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Protocollo Di Analisi Della Proteina Di Lowry

Determinazione di concentrazione nella proteina dal protocollo di analisi di Lowry Prtoein

Materiali

1. Complesso-formare reagente: Preparisi immediatamente prima di uso mescolando le seguenti soluzioni di riserva nella proporzione 100:1:1 (dal volume), rispettivamente:
            Soluzione A: 2% (w/v) Na2CO3 in acqua distillata.
            Soluzione B: 1% (w/v) CuSO4·5H2O in acqua distillata.
            Soluzione C: tartrato del potassio del sodio di 2% (w/v) in acqua distillata.

2. Prepari Un NacOh Di 2 N.

3. Reagente della folina (disponibile in commercio): Uso a 1 concentrazione di N.

4. Standard: Usi una soluzione di riserva di proteina standard (per esempio, frazione dell'albumina del siero di bue V) che contiene una proteina di 2 mg/mL in acqua distillata, memorizzata congelato –a 20°C. Prepari gli standard diluendo la soluzione di riserva con l'acqua distillata come segue:

Immagazzini la soluzione   (µL)     0         2.5      5          12.5     25        50        125      250      500

Acqua                (µL)     500      498     495      488      475      450      375      250      0
Proteina concentrata.    (µg/mL) 0          10       20        50        100      200      500      1000    2000

Metodo

1. A 0.1 ml di campione o standard, aggiunga 0.1 ml di NacOh di 2 N. Idrolizzi a 100°C per 10 minuti in un blocchetto del heating o in un d'acqua bollente.

2. Raffreddi l'idrolizzato alla temperatura ambiente ed aggiunga 1 ml di mescolato di di recente complesso-formando il reagente. Lasci la soluzione levarsi in piedi alla temperatura ambiente per 10 minuti.

3. Aggiunga 0.1 ml di reagente della folina, usando un miscelatore di vortice e lasci il basamento della miscela alla temperatura ambiente per 30–60 minuti (non eccedi 60 minuti).

4. Legga la capacità di assorbimento a 750 nm se la concentrazione nella proteina fosse inferiore a 500 µg/mL o a 550 nm se la concentrazione nella proteina fosse fra 100 e 2000 µg/mL.

5. Tracci una curva standard di capacità di assorbimento in funzione di concentrazione iniziale nella proteina ed usila per determinare le concentrazioni sconosciute nella proteina.

Riferimenti Di Metodo Di Lowry

Sulla base del protocollo da Jakob H. Waterborg.

Lowry ed altri. J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)

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