Patrocini/Faccia pubblicità a & Colleghisi a noi & Seli metta in contatto con & Circa noi & Aiutili

Biologia Molecolare Blog

Alberini Recenti Della Tribuna

 

Immunoprecipitazione

L'immunoprecipitazione è una tecnica che usa gli anticorpi specifici ad una proteina per rimuovere quelle proteine dalla soluzione. I complessi della anticorpo-proteina sono precipitati dalla soluzione con l'aggiunta di una forma insolubile delle proteine obbligatorie dell'anticorpo. Gli esempi includono la proteina A, la proteina G, Zysorbin, Immunoprecipitin, o l'aggiunta di un secondo anticorpo alla soluzione (veda lo schema 1 qui sotto).

Indice di immunoprecipitazione

1. Priorità bassa Di Immunoprecipitazione
2. Amplificatori Di Immunoprecipitazione
3. Soggetti Recenti Di Immunoprecipitazione
4. Protocolli Di Immunoprecipitazione
5. Bollettino Di Immunoprecipitazione
6. Articoli Di Immunoprecipitazione
7. Analisi guasti Di Immunoprecipitazione

Schema 1.

I campioni possono allora essere lavati dopo precipitazione e centrifugazione. I precipitati possono allora essere fatti funzionare sui gel di SDS-PAGE con l'amplificatore del campione della proteina. I campioni della proteina sono solitamente radioattivi prima di lysis delle cellule. Ciò è fatta solitamente aggiungendo gli amminoacidi radioattivi alle cellule. Ciò rende le cose semplici mentre la proteina allora è rilevata facilmente sulla pellicola una volta in funzione su un gel come il punto emetterà la pellicola di denunzia e di radioattività. Potete allora valutare per il formato della proteina (nel peso molecolare con il confronto per graduare gli standard secondo la misura) e la quantità (confrontando i campioni trattati o ad un livello delle quantità).

Inoltre, la procedura di immunoprecipitazione egualmente permette la concentrazione delle proteine che non sono molto abbondanti o difficili da rilevare usando la macchia occidentale. Il IP può concentrare le proteine fino a 10,000-fold mentre può prendere i grandi volumi dei lysates delle cellule e concentrare la vostra proteina di interesse in un piccolo precipitato che può allora essere usato per analisi occidentale della macchia o altri metodi.

 

Applicazioni di immunoprecipitazione:

1) la determinazione del peso molecolare e della quantità di immunoprecipitated la proteina da SDS-PAGE.

2) l'immunoprecipitazione è usata per valutare per le interazioni della proteina-proteina. Ciò è fatta immunoprecipitazione per una proteina ed allora macchiandosi per un'altra proteina.

3) quantificazione del tasso della sintesi di una proteina in cellule determinando la proteina radioattiva di quantità fatta durante il tempo specifico.

4) l'immunoprecipitazione permette a concentrazione delle proteine che sono al contrario difficili da rilevare.

 

Il metodo di immunoprecipitazione può essere diviso in parecchi punti:

1. Preparazione del campione e lysis delle cellule
2. Preclearing della soluzione
3. Incubazione con l'anticorpo e la formazione dei complessi dell'anticorpo-antigene
4. Precipitazione del complesso di interesse
5. Lavaggio dei complessi dell'anticorpo-antigene per rimuovere le proteine e gli agenti inquinanti di non-specifico.
6. Analisi di complexes/antigen di interesse da SDS-PAGE

Protocolli Di Immunoprecipitazione	Indice di protocollo di immunoprecipitazione (collegamenti esterni)	Effettui un analisi guasti Dell'Immunoprecipitazione	Impari circa immunoprecipitazione

Preparazione del campione di immunoprecipitazione e lysis delle cellule

 

Amplificatori Di Lysis Di Immunoprecipitazione

Secondo l'applicazione di immunoprecipitazione o del IP, desidererete usare gli amplificatori differenti di lysis.  La scelta dell'amplificatore di lysis è importante e dipende dalle caratteristiche della proteina di interesse.

Se desideri studiare la fosforilazione delle proteine o delle interazioni della proteina-proteina, dovreste provare Np-40.

Se state studiando i livelli della proteina totale di una proteina, dovreste provare RIPA.

L'amplificatore di RIPA dà la priorità bassa più bassa nell'immunoprecipitazione. Tuttavia, RIPA può denaturare alcune proteine. Se state conducendo l'immunoprecipitazione sperimenta per studiare le interazioni della proteina-proteina, RIPA non dovrebbe essere usata mentre può interrompere le interazioni di protein:protein.

L'amplificatore NP-40 ha un più basso livello deanturing e così è usato per gli esperimenti di fosforilazione come guardare l'attività della chinasi. Egualmente NP-40 è usato per le interazioni della proteina-proteina. NP40 è un detersivo non ionico ed è il detersivo il più comunemente usato negli amplificatori di lysis delle cellule per immunoprecipitazione e la macchia occidentale.

Amplificatore Di Lysis Delle Cellule di RIPA - Ricetta Dell'Amplificatore Di Immunoprecipitazione

• 50 millimetri Tris-HCl
• Registri a pH 7.4
• 150 millimetri di NaCl
• 1 millimetro PMSF
• un EDTA da 1 millimetro
• 5 µg/ml Aprotinin
• 5 µg/ml Leupeptin
• 1% Tritone x-100
• deossicolato del sodio di 1%
• 0.1% Sds

Amplificatore Di Lysis Delle Cellule NP-40 - Ricetta Dell'Amplificatore Di Immunoprecipitazione

• 50 millimetri di Tris-HCl di concentrazione di finale
• 150 millimetri del NaCl di concentrazione di finale
• Aggiunga 1% NP-40
• Registri a pH 8.0

Pre-schiarimento per l'immunoprecipitazione

Il punto preclear è fatto solitamente per immunoprecipitazione perché abbassa la quantità di proteine di non-specifico nel lysate delle cellule. Ancora, lo pre-schiarimento egualmente rimuove le proteine che possono avere le interazioni possibili di non-specifico e un'alta affinità per proteina A, la proteina il G, Immunoprecipitin, Zysorbin, o il che cosa forma insolubile della proteina obbligatoria dell'anticorpo state usando a pull-down il vostro anticorpo. Alcuni ricercatori trovano questo punto inutile e saltano questo punto. Pre-schiarimento di prova la prima volta provate l'immunoprecipitazione. Se i vostri risultati sono abbastanza chiari, provi a saltare l'esperimento seguente di pre-schiarimento e veda come risulta.

 

IP: Anticorpo di incubazione e formazione dei complessi dell'Anticorpo-Antigene

Quale anticorpo dovreste usare per immunoprecipitazione? Gli anticorpi di Polyclonal sono usati solitamente per il immunoprecipation.

 

Immunoprecipitazione - precipitazione del complesso di interesse

I complessi dell'anticorpo-antigene non sono insolubili da soli, immunoprecipitazione dello IE, non è un'idea completa. Gli anticorpi ed il loro grippaggio agli antigeni sono solubili nell'anima, amplificatori e durante l'esperimento di immunoprecipitazione.  Che cosa è usato per precipitare verso l'esterno questi complessi è proteine obbligatorie dell'anticorpo insolubile. Le proteine A e G, sono state isolate dai batteri e dalla legatura alla regione costante dell'anticorpo.

Gli esempi delle proteine obbligatorie dell'anticorpo insolubile usate per precipitare i complessi nell'immunoprecipitazione sono:

• Proteina A
• Proteina G
• Zysorbin
• Immunoprecipitin

Immunoprecipitazione - Punti Di Lavaggio

  Il lavaggio dei complessi è fatto usando RIPA, PBS, IP-LAVA l'amplificatore, o altri amplificatori secondo che cosa vorreste analizzare dopo il IP. L'amplificatore di RIPA è più rigoroso mentre PBS è meno rigoroso.

Ricetta Dell'Amplificatore Della Lavata del IP

• 10mM Tris; Registri a pH 7.4
• EDTA di 1mM
• 1mM EGTA; pH 8.0
• NaCl di 150mM
• 1% Tritone X-100
• sodio di 0.2mM orto-vanadate
• cocktail dell'inibitore della proteasi

 

Note finali per immunoprecipitazione

  Il successo di immunoprecipitazione dipende dall'affinità dell'anticorpo per il relativo antigene.  Un buon anticorpo di immunoprecipitazione vi darà la priorità bassa bassa quando analizzate i campioni usando altre tecniche dopo il IP.  Le proteine anticorpo-legantesi insolubili usate sono egualmente molto importanti. Gli anticorpi di Polyclonal sono gli anticorpi migliori per usare gli anticorpi monoclonal tuttavia purificati possono anche essere usati.  Controlli il vostro fornitore dell'anticorpo per vedere se il vostro anticorpo monoclonal fosse esaminato ad immunoprecipitazione.

 

Punte per immunoprecipitazione

• Utilizzi i tubi da 2 ml per immunoprecipitazione come precipitano più facilmente sono lavati e risospesi
• Provi a saltare il punto di pre-schiarimento per salvare il tempo
• Invece di lavaggio con IP-LAVI la prova PBS dell'amplificatore
• Se già avete priorità bassa bassa ed il vostro anticorpo è grande, provi il IP che lava 2X anziché 5X
• Vi assicurate rimuovere tan liquido dai tubi del eppendorf quando lavaggio di immunoprecipitazione

Stazione Molecolare Del Copyright 2006-2008