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Protocollo Di Immunoprecipitazione

Immunoprecipitazione e protocolli.

IP Di base Di Protocollo Di Immunoprecipitazione:

1. Tratti le vostre cellule

2. Raccolga le cellule aggiungendo 500 uL della solubilizzazione dell'amplificatore, raschi ed attraversi la siringa 21-gauge tempi dell'ago un X5 di omogeneizzare.

3. Conduca una precipitazione del TCA (questo sarà usato per normalizzare se voi radioattivi le cellule per esempio con S-35)

4. Pre-schiarimento: Pre-libero aggiungendo 2 uL della X, mouse o coniglio o siero della capra (dove la X è la specie animale in cui l'anticorpo primario è stato alzato) ai campioni interi ed incubi in un rotatore per 30 minuti alla temperatura ambiente.

5. Rimuova il siero di X incubando con un immunoprecipitin di 30 uL con una rotazione di 30 minuti alla temperatura ambiente.

6. Centrifughi i campioni per 3 minuti a 13, 000 giri/min..

7. Dopo centrifugazione, aggiunga 5 uL dell'anticorpo primario (proteina specifica anti-Y di X, in cui Y è l'anticorpo alzato in un animale per la vostra proteina di interesse) ai supernatants ed incubi durante la notte a 4 gradi di C.

8. Aggiunga 100 uL del immunoprecipitin ai campioni. Potete usare alternativamente Zysorbin (Invitrogen). (Zysorbin richiede alcuni cambiamenti secondari al protocollo)

9. Centrifuga a 13, 000 giri/min. per 3 minuti. Rimuova il galleggiante.

10. Lavi la pallina 3 X con 1 ml di amplificatore freddo della lavata del IP (aggiunga gli inibitori della proteasi all'amplificatore del wah prima di uso) con l'agitazione per 5-10 minuti fra ogni lavata.

11. Usi questa pallina per funzionare su un gel di SDS-PAGE. Potete aggiungere l'amplificatore del campione di SDS (amplificatore di caricamento della proteina) al questo ed il carico sul gel direttamente dopo l'ebollizione.

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