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Protocollo Di Analisi Della Proteina De Bradford

Concentrazione Determinatino nella proteina usando il metodo di accertamento de Bradford

Materiali per l'analisi de Bradford

1. Reagente: Il reagente di analisi è fatto dissolvendo il magnesio 100 di Coomassie G250 blu in 50 ml di etanolo di 95%. La soluzione allora è mescolata con 100 ml di acido fosforico di 85% e si compone a 1 L con acqua distillata. Il reagente dovrebbe essere filtrato attraverso la carta da filtro di Whatman il no. 1 ed allora essere memorizzato in una bottiglia ambrata alla temperatura ambiente. È stabile per parecchie settimane. Tuttavia, durante questo tempo tintura può precipitare dalla soluzione ed in modo da il reagente memorizzato dovrebbe essere filtrato prima dell'uso.

2. Standard della proteina. Bovino γ- la globulina ad una concentrazione di 1 mg/mL (100 µg/mL per la microanalisi) in acqua distillata è usata come soluzione di riserva. Ciò dovrebbe essere memorizzata congelata –a 20oC. Poiché il tenore d'acqua di proteina solida può variare durante la memoria, la concentrazione precisa di proteina nella soluzione titolata dovrebbe essere determinata a partire dalla relativa capacità di assorbimento a 280 nm. La capacità di assorbimento di una 1 soluzione di mg/mL di γ- la globulina, in un percorso chiaro di çentimetro, è 1.35. I valori corrispondenti per due standard della proteina, albumina del siero di bue ed ovalbumine alternativi, sono 0.66 e 0.75, rispettivamente.

3. La plastica e la cristalleria usate nell'analisi dovrebbero essere assolutamente pulite e detersivo liberamente. Le provette dello spettrofotometro del quarzo (silicone) non dovrebbero essere utilizzate, poichè la tintura si lega a questo materiale. Le tracce del limite della tintura a cristalleria o a plastica possono essere rimosse risciacquando con metanolo o la soluzione detersiva.

 Metodo Di Accertamento Standard De Bradford

1. Pipetti fra µg 10 e 100 di proteina in un volume totale dei 100 µL in una provetta. Se la concentrazione approssimativa del campione è sconosciuta, analizzi una gamma di diluzioni (1, 1:10, 1:100, 1:1000). Prepari i duplicati di ogni campione.

2. Per la curva di calibratura, pipetti i volumi duplicati 10, 20, 40, 60, 80 e 100 di un µL di 1 mg/mL γ- soluzione titolata della globulina nelle provette e renda ciascuno fino a 100 µL con acqua distillata. Pipetti il µL 100 di acqua distillata in un tubo ulteriore per fornire lo spazio in bianco del reagente.

3. Aggiunga 5 ml di reagente della proteina ad ogni tubo e mescoli bene dall'inversione o addolcisca vortexmixing. Evitare formazione di schiuma, che condurrà alla povera riproducibilità.

4. Misuri il A595 dei campioni e degli standard in rapporto allo spazio in bianco del reagente fra 2 minuti e 1 h dopo la miscelazione. Lo standard dei 100 µg dovrebbe dare un valore A595 di circa 0.4. La curva standard non è lineare e la capacità di assorbimento precisa varia secondo l'età del reagente di analisi. Di conseguenza, è essenziale per costruire una curva di calibratura per ogni insieme delle analisi.

Il metodo di microanalisi questa forma dell'analisi è più sensibile a proteina. Di conseguenza, è utile quando la quantità della proteina sconosciuta è limitata (veda inoltre la nota 9). 1. Pipetti i campioni duplicati che contengono fra il µg 1 e 10 in un volume totale di µL 100 nei tubi del microfuge del polietilene 1.5-mL. Se la concentrazione approssimativa del campione è sconosciuta, analizzi una gamma di diluzioni (1, 1:10, 1:100, 1:1000).

2. Per la curva di calibratura, pipetti i volumi duplicati 10, 20, 40, 60, 80 e 100 di un µL di 100 µg/mL γ- soluzione titolata della globulina nei tubi del microfuge e registri il volume a µL 100 con acqua. Pipetti il µL 100 di acqua distillata in un tubo per lo spazio in bianco del reagente.

3. Aggiunga 1 ml di reagente della proteina ad ogni tubo e mescoli delicatamente, ma completamente.

4. Misuri la capacità di assorbimento di ogni campione fra 2 e 60 minuti dopo l'aggiunta del reagente della proteina. Il valore A595 di un campione che contiene µg 10 γ- la globulina è 0.45.

veda inoltre: Analisi Della Proteina De Bradford

Riferimenti per l'analisi de Bradford

Modificato dal protocollo da Nicholas J. Kruger.

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