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Metodi ed analisi di rilevazione di Microarray della proteina

Proteina ed anticorpo Microarrays

Metodi ed analisi di rilevazione per i circuiti integrati dell'anticorpo e della proteina

Metodi di rilevazione e grippaggio di Non-specifico
            Non-specifico che si lega all'allineamento deve essere minimizzato e questo è fatto tipicamente immergendo gli allineamenti in un amplificatore basato l'albumina del siero di bue (BSA) (31).
            Analyte-legandosi ed il ritegno sugli allineamenti della proteina continuano via il meccanismo di legatura thermodinamicamente guidato simile all'ibridazione degli obiettivi dell'acido nucleico alle sonde.  Tuttavia, la rilevazione degli obiettivi rilegati alle proteine è considerevolmente più complessa di quella di rilevazione microarray del DNA (9).  Attualmente una varietà di metodi di rilevazione sta esaminanda.  Per esempio, ELISA in primo luogo è stato usato per rilevare le proteine per sia gli allineamenti del filtro (66.67) che gli allineamenti di vetro (68).  I metodi di rilevazione basati ELISA presentano lo svantaggio della non-specificità delle interazioni dell'proteina-anticorpo, conducente a molti positives falsi.   Identificare del radioisotopo è stato usato da Ge ed altri. (22), radioisotopo che identifica per studiare la proteina–della proteina, DNA–della proteina, interazioni–della droga della proteina sugli allineamenti del filtro.  Zhu ed altri. radioisotopo usato che identifica per condurre le analisi della chinasi dei substrati differenti usando le proteine purificate della chinasi del lievito su un allineamento (36).  Il metodo preferito di rilevazione è rilevazione di fluorescenza perché questi metodi sono generalmente sicuri, estremamente sensibile, semplice e può avere molto di alta risoluzione.  Questi metodi di rilevazione sono egualmente compatibili con i dispositivi d'esplorazione microarray standard. Generalmente, un circuito integrato è uno direttamente sondato con una molecola fluorescente (per esempio una proteina fluorescently identificata o una piccola molecola, usando una sonda etichettata (per esempio biotina), che può allora essere rilevata ad un secondo punto usando un reagente fluorescently identificato di affinità (per esempio streptavidin) (16.56). Un altro metodo identificante fluorescente è amplificazione del cerchio di rolling (RCA), che è egualmente estremamente sensibile (32).  
            Anche se i proteomes sotto il confronto possono essere identificati ad un modo paragonabile con i fluorophores, la riproducibilità di queste reazioni chimiche è povera ed interferenza con i presenti di interazioni dell'proteina-anticorpo una complessità supplementare (9). Inoltre, identificare di non-uniforme delle proteine può essere indirizzato effettuando un'analisi ratiometric di doppio-colore, dove uno standard interno è presente per ogni proteina dell'obiettivo che è misurata (9).          Uno svantaggio delle proteine identificanti con i fluorophores è una riduzione dell'esattezza quantitativa dell'analisi, poichè l'incorporazione dell'etichetta può alterare le proprietà obbligatorie delle proteine (9).

Anche se i metodi di rilevazione identificanti della proteina diretta ancora ampiamente sono usati, i problemi intrinsechi accennati ha provocato liberamente l'uso aumentante dei metodi di rilevazione dell'etichetta per i microarrays della proteina.  Questi metodi sono spettrometria totale (MS), microscopia atomica della forza (AFM) (70) e risonanza di superficie del plasmon (SPR) (71). 
i metodi Non-identificanti presentano i vantaggi come metodo diretto di rilevazione per i microarrays dell'anticorpo poiché identificare le molecole interessa l'attività della proteina. La spettrometria totale di SELDI (laser superficie-aumentato desorption/ionization) è stata usata per rilevare gli allineamenti a bassa densità delle proteine bloccate (69). Le proteine sono bloccate su un allineamento della superficie del metallo (allineamento della proteina di SELDI) e sono vaporizzate usando un fascio laser.  L'analisi che usando i dati di spettrometria totale allora è effettuata per rivelare le identità di queste proteine.

            Cambiamenti topologici della forza di microscopia (AFM) di metodo della superficie atomica di usi per identificare le proteine bloccate su un allineamento dell'anticorpo (70).  Quando il coniglio IgG è immobilizzato su una superficie dell'oro e si lega ai relativi anticorpi gratuiti, il formica-coniglio IgG, AFM della capra rileva l'aumento di l'altezza e così può misurare legare le interazioni.  Comunque per studiare la cinetica delle interazioni–dell'anticorpo dell'antigene, i metodi di rilevazione in tempo reale saranno utili.  La risonanza di superficie del plasmon (SPR) ha fatto maturare in uno strumento versatile di rilevazione per studiare la cinetica delle interazioni–del ligand del ricevitore con una vasta gamma dei pesi molecolari, delle affinità e dei tassi obbligatori (72-74). I circuiti integrati commerciali di SPR sono disponibili tuttavia la loro risoluzione di rilevazione è limitati.  Una superficie del sensore con 64 diversi luoghi di immobilizzazione in una singola cellula di flusso è stata sviluppata (75).  Un biosensore di allineamento dell'anticorpo egualmente è stato sviluppato per studiare la cinetica dell'antigene che si lega per mezzo di una guida di onde planare come il metodo di rilevazione. Usando questo metodo, il gruppo ha dimostrato che l'intensità significativa del segnale potrebbe essere realizzata dai punti piccoli quanto 200 millimetri di diametro. Quindi è previsto che questo metodo sia adatto aalto-rendimento ed a studi paralleli di cinetica. (76).

Gamma di rilevazione
            Un'altra differenza fra proteina ed i microarrays del DNA è che le concentrazioni nella proteina in singolo campione biologico o cellule sono parecchi ordini di magnitute più grandi di quello per i mRNAs.  Così i sistemi del rivelatore di circuito integrato della proteina devono avere una gamma molto vasta di funzionamento di rilevazione – fino ad un fattore di 1014, confrontato a 104 per il mRNA.  Così un anticorpo con l'affinità nanomolar ad un obiettivo particolare sarà saturato dalla presenza di questo obiettivo alle concentrazioni micromolar e non riuscirà a rilevare i livelli previsti femtomolar o del pico-.  Così accomodare le proteine rare ed abbondanti probabilmente richiederà gli allineamenti separati (7.8.9).
            Gli anticorpi multipli con le affinità di variazione per l'obiettivo possono essere posizionati alle zone differenti degli studi di allineamento tuttavia hanno indicato che soltanto 20% degli anticorpi allineati forniscono le misure delle proteine alle concentrazioni basse (33). 

Dopo: Produzione della proteina per gli allineamenti della proteina

Riferimenti per proteina e l'anticorpo Microarrays

Di nuovo a:

Introduzione e priorità bassa ai circuiti integrati della proteina ed ai circuiti integrati dell'anticorpo.

Tipi di circuiti integrati della proteina e dell'anticorpo