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PCR Ha basato La Mutagenesi Diretta Luogo

Mutagenesi Del Luogo Di Reazione a catena Della Polimerasi

Impari circa mutagenesi diretta luogo basata PCR.

(riferiscasi allo schema qui sotto)

Cominci in primo luogo con un plasmide che contiene un gene con un codon della tirosina di TAC che desideriamo alterare ad un codon della fenilalanina di TTC. Per per compire questo che dobbiamo cambiare all'accoppiamento (blu) nell'originale ad un accoppiamento dell'AT. Questo plasmide è stato isolato da uno sforzo normale di E.coli che metila a partire dalle sequenze di GATC. I gruppi metilici sono indicati nel colore giallo. Le seguenti operazione sono effettuate per compire questa:

• Riscaldi il plasmide per separare i relativi fili.
• Allora tempriamo gli iniettori mutageni che contengono il codon di TTC, o il relativo complemento d'inversione, GAA. La base alterata in ogni iniettore è indicata nel colore rosa.
• Allora effettuiamo alcuni tondi di PCR (circa 8) con gli iniettori mutageni per amplificare il plasmide con il codon alterato. Usiamo una polimerasi termostabile del DNA, quale la polimerasi di Pfu, per minimizzare gli errori nella copiatura del plasmide.
• Allora trattiamo il DNA nella reazione di PCR con DpnI per digerire il selvaggio-tipo metilato DNA. Poiché il prodotto di PCR è stato reso in vitro, non è metilato e non è tagliato. Trasformiamo infine le cellule del E. coli con il DNA trattato. In linea di principio, soltanto il DNA mutato sopravvive per trasformare. Ciò è controllata ordinando il DNA in serie del plasmide da vari clona.



Fattori per un PCR riuscito

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Soggetti Della Tribuna Di Mutagenesi

Filetti
Titolo/Manifesto Del Filetto	Ultimo Alberino	Risposte	Viste
aiuti prego le informazioni me-di base su mutagenesi luogo-diretta PCR tripsina	05-01-2008 06:21 PM da kmunson779 "	1	145
mutagenesi diretta luogo usando Invitrogen Genetailor satishreddy27	06-19-2007 03:34 PM da satishreddy27 "	0	526

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Soggetti Della Tribuna di PCR

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