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Reazione a catena Della Polimerasi - PCR
Indice:
Introduzione a PCR - reazione a catena della polimerasi
Reazione a catena Della Polimerasi (PCR)
Specificità e risparmio di temi di Polymerases/Reaction
Misincorporation: Errori dei sistemi in vitro
PCR sarà sostituito mai? – Amplificazione Helicase-dipendente (HDA)
Più di 30 anni fa, l'introduzione di tecnologia di DNA recombinant come uno strumento per le scienze biologiche ha rivoluzionato lo studio su vita. La clonazione molecolare ha permesso lo studio di diversi geni degli organismi viventi; tuttavia questa tecnica dipendeva dall'ottenere una quantità relativamente grande di DNA puro. Ciò dipendeva dalla replica del DNA dei plasmidi o di altri vettori durante la divisione delle cellule dei microorganismi (1). I ricercatori la hanno trovata estremamente laboriosa e difficile ottenere un DNA specifico nella quantità dalla massa di geni presenti in un campione biologico (2). La tecnologia di DNA recombinant ha reso possibile la prima analisi molecolare e la diagnosi prenatale di parecchie malattie umane. Il DNA fetale ottenuto tramite il campione di amniocentesi ha potuto essere analizzato tramite digestione degli enzimi di limitazione, l'elettroforesi, il trasferimento del sud e l'ibridazione ad un gene clonato o alle sonde del oligonucleotide (3). Tuttavia, macchiarsi del sud ha consentito soltanto il tracciato rudimentale dei geni in individui indipendenti (4).
PCR, un acronimo per reazione a catena della
polimerasi (5.6), ha permesso la produzione di grandi quantità di DNA
specifico da una mascherina complessa del DNA in una reazione
enzimatica semplice. PCR è una procedura recentemente
elaborata per l'amplificazione in vitro di DNA. PCR ha trasformato il
modo che quasi tutto studia richiedere la manipolazione dei frammenti
del DNA può essere effettuato come risultati della relative
semplicità ed utilizzabilità (7).
Negli anni 80, Kary Mullis (figura 1) e una squadra dei
ricercatori a Cetus Corporation a Cetus Corporation immaginata un modo
iniziare ed arrestare azione della polimerasi ai punti specifici
lungo un singolo filo di DNA. Mullis egualmente si è
reso conto che sfruttando questo componente di tecnologia molecolare
della riproduzione, il DNA dell'obiettivo potrebbe esponenzialmente
essere amplificato. Questa procedura di amplificazione
del DNA è stata basata su un processo in vitro piuttosto che in vivo
(5.6.8). L'amplificazione senza cellula del DNA da PCR
poteva facilitare molti delle procedure standard per clonazione,
analizzanti e degli acidi nucleici di modificazione (1). Le tecniche precedenti per l'isolamento della parte
specifica di DNA hanno contato sul gene che clona – una
procedura noiosa e lenta. PCR, d'altra parte kerry
Mullis dichiarato “li lascia selezionare la parte
di DNA voi’con riferimento ad interessato dentro ed
avergli tanto mentre desiderate” (2.8). Quando altri scienziati di Cetus finalmente sono
riuscito a rendere alla polimerasi la reazione a catena effettui come
voluto ad un modo certo, hanno avuti una tecnica immenso potente per
fornire essenzialmente alle quantità illimitate dei biologhi
molecolari materiali genetici
precisi e di altri richiesti per il loro lavoro (8). Dal
primo rapporto in1985, più di 5000 carte scientifiche sono state
pubblicate da 1992 (1). Ancora, the.large.number.of
pubblicazioni naturalmente lo rende impossible rivedere tutti i
contributi importanti allo sviluppo ed all'applicazione di tecnologia
di PCR; tuttavia tenteremo di rivedere qui gli sviluppi più
importanti nella pratica di PCR di base.
PCR si è pensato per essere concepito dal Dott.
Kerry Mullis in 1983 mentre funzionava al Cetus Corporation in
Emeryville, CA. Tuttavia, un certo lavoro aprente la
strada egualmente è stato fatto da Gobind Khorana in 1971 chi ha
descritto un principio di base di replica della parte di DNA per mezzo
di due iniettori. Il progresso allora è stato limitato
dalle edizioni più supereleganti di purificazione della polimerasi e
di sintesi (9). In testa’di Mullis s,
l'invenzione si è sviluppata da uno schema teorico per realizzare
ordinare limitato di dideoxynucleotide dei geni umani unici usando i
oligonucleotides sintetici allo scopo di le mutazioni umane comuni
diagnosticare di malattia. Un ostacolo evidente a così
strategia ordinante diretta era l'alta complessità degli
accoppiamenti bassi del genome (3.3 x 109) umani. Quindi, un secondo oligonucleotide o iniettore è stato
aggiunto per ostruire la progressione della sintesi del primo
iniettore. Più successivamente tuttavia, questo secondo
iniettore è stato incluso per legarsi all'altro filo del DNA, di modo
che ogni filo dell'allele del mutante contribuirebbe al segnale
finale. Se lo schema che coinvolge l'ibridazione
simultanea degli iniettori ad ogni filo fosse modificato riscaldando
la miscela ed allora ripetendo la ricottura ed i punti di estensione,
allora il segnale primario sarebbe ancora ulteriore aumentato. Ripetere i punti permetterebbe ai prodotti del primo
tondo di essere duplicato nel secondo ciclo, per rendere due copie. Ripetere il ciclo provocherebbe ancora quattro copie et cetera. Parecchie settimane passate prima di questa idea grande
sono state tentate (8). Due iniettori sono stati
sintetizzati per essere perfettamente complementari ad ogni
conclusione della regione bassa di accoppiamento 110 di un segmento
clonato del gene umano del b-globin, l'amplificazione è stata
effettuata ed i prodotti sono stati identificati tramite
l'elettroforesi del gel dell'acrilamide. Il risultato
finale era il frammento basso previsto del DNA di accoppiamento 110 e
l'inizio di PCR come tecnica di base nella biologia molecolare (5.6).
In PCR originale del Mullis process(5,6,8), l'enzima è stato
usato in vitro (in un ambiente
controllato fuori di un organismo). Il DNA
double-stranded è stato separato in due singoli fili riscaldandolo a
96°C. A questa temperatura, tuttavia, la polimerasi del DNA di E.Coli
è stata distrutta in modo che l'enzima dovesse essere
riempito dopo la fase del heating di ogni ciclo. Il
processo originale di PCR del Mullis era molto inefficiente poiché ha
richiesto il moltissimo periodo, i grandi importi della DNA-Polimerasi
e l'attenzione continua durante il processo di PCR.
L'esame del meccanismo di amplificazione di PCR
rivela la relativa semplicità ma anche la relativa eleganza (figura
2). Gli iniettori del oligonucleotide in primo luogo
sono destinati per essere complementari alle conclusioni della
sequenza da amplificare ed allora mescolata nell'eccesso molare con la
mascherina del DNA e nei deoxyribonucleotides in un amplificatore
adatto. Heating seguente per denaturare i fili di
originale e raffreddamento per promuovere ricottura più
superelegante, i oligonucleotides ogni legatura ad un filo differente
del frammento dell'obiettivo. Gli iniettori sono
posizionati in modo che quando ciascuno si estende tramite l'azione di
una polimerasi del DNA, i fili recentemente sintetizzati coincidano il
luogo obbligatorio del oligonucleotide opposto. Mentre
il processo di denaturazione, della ricottura e dell'estensione della
polimerasi è continuato gli iniettori si legano ripetutamente sia
alla mascherina originale del DNA che ai luoghi complementari nei fili
recentemente sintetizzati e si estendono per produrre le nuove copie
di DNA (figura 3). Il risultato finale è un aumento
esponenziale nel numero totale di frammenti del DNA che includono le
sequenze fra gli iniettori di PCR, che infine sono rappresentati ad
un'abbondanza teorica di 2n, dove la n è il numero di cicli (1.7.13).
Una polimerasi del DNA è un enzima naturale, una macromolecola biologica
che catalizza la formazione e la riparazione di DNA. Funziona
legandosi ad un singolo filo del DNA e creando un filo complementare. La replica esatta di tutta la materia vivente dipende da
questa attività, dove funziona per duplicare il DNA quando le cellule
si dividono (10.11). Soltanto recentemente impari gli
scienziati per maneggiare questa attività e per applicarla a ricerca
scientifica. Gli esperimenti di PCR più iniziali
utlilized il frammento di Klenow della polimerasi I del DNA di
Escherichia coli ad una temperatura di 37C per amplificare gli
obiettivi specifici da DNA genomic umano (5.6). Queste
reazioni di PCR hanno prodotto spesso il prodotto in modo incompleto
puro dell'obiettivo come giudicato tramite l'elettroforesi del gel
(1). Queste amplificazioni iniziali di PCR con il
frammento di Klenow non erano altamente specifiche (5.6). Anche se un frammento unico del DNA potrebbe essere
popolare amplificato ~200,000 da DNA genomic, solo circa 1% del
prodotto di PCR era la sequenza designata (13). Una
sonda specifica di ibridazione è stata richiesta analizzare il DNA
amplificato (5.6).
Stati di qualche PCR sono stati determinati per aumentare il
rigore dell'ibridazione più superelegante quali le concentrazioni
più basse nel MgCl2 e le più alte temperature di ricottura.
Ancora, la concentrazione dell'enzima e degli iniettori, il
periodo di ricottura, il tempo di estensione ed il numero di PCR cicla
tutta sono stati trovati per effettuare la specificità del PCR.
Inoltre, la concentrazione di una sequenza specifica in un
campione può anche influenzare l'omogeneità relativa dei prodotti di
PCR (1.7.13.14.15). I trifosfati ed il magnesio di
Deoxyribonucleotide in un amplificatore adatto sono egualmente
ingredienti importanti per PCR. Il risparmio di temi e
la specificità di PCRs possono essere influenzati tramite le
variazioni nella concentrazione e nel rapporto di magnesio, dei
trifosfati di deoxyribonucleotide e degli iniettori liberi. Questi reagenti devono essere ottimizzati per realizzare
l'alti specificità e rendimento (14). Egualmente è
stato scoperto che l'effetto della temperatura e della lunghezza
dell'iniettore del oligonucleotide sulla specificità e sul risparmio
di temi dell'amplificazione dalla reazione a catena della polimerasi
(15).
L'inattivazione del frammento di Klenow della polimerasi I
del DNA di Escherichia coli alla temperatura elevata richiesta per la
separazione del filo ha richiesto l'aggiunta dell'enzima dopo il punto
di denaturazione di ogni ciclo (5.6). Prima di 1988,
chiunque che conduce una procedura di reazione di PCR è stato
obbligato per sedersi pazientemente da una serie di bagni dell'acqua o
di blocchi di riscaldamento e per aggiungere un'aliquota fresca della polimerasi del DNA
di E.Coli dopo ogni punto di denaturazione, che è stato
effettuato tipicamente immergendo il vaso di reazione in acqua di
ebollizione per ½ un minuto a 3 minuti (7). Questo punto piuttosto noioso è stato eliminato una
volta tramite l'introduzione di una polimerasi termostabile del DNA, la polimerasi del DNA di Taq
(12), all'inizio della reazione di PCR. Le
proprietà termostabili dell'attività della polimerasi del DNA sono
state isolate dal aquaticus di Thermus (Taq) (figura 4) che si
sviluppano in geyser di 110C eccessivo ed ha contribuito notevolmente
al rendimento, alla specificità, all'automazione ed al programma di
utilità della reazione a catena della polimerasi (1.7.12). L'enzima di Taq
può sostenere il heating ripetuto a 94C e così ogni volta la
miscela è raffreddata per permettere che gli iniettori del
oligonucleotide si leghino il catalizzatore per l'estensione è già
presente (1.7). Tuttavia, le più alte temperature di
ricottura non sono state stabilite fino al singolo “sviluppo più importante di sviluppo di PCR” (8), della purificazione e della distribuzione
commerciale di una polimerasi termoresistente del DNA dal
aquaticus termofilo di Thermus del
batterio (Taq) (12).
L'isolamento di una polimerasi termoresistente del DNA
egualmente ha permesso la ricottura più superelegante e l'estensione
da effettuare alle temperature elevate (1.7.12.13), quindi riducenti
ha mal adattato la ricottura alle sequenze del nontarget
(amplificazione di non-specifico) o alla specificità aumentante. In questo modo, dato che molte amplificazioni il
prodotto di PCR potrebbe essere rilevato come fascia bromuro-macchiata
singolo etidio su un gel elettroforetico (12). Questa
specificità aumentata egualmente ha aumentato il rendimento del DNA
della sequenza dell'obiettivo. Inoltre, i prodotti più
lunghi di PCR hanno potuto essere amplificati da DNA genomic,
probabilmente dovuto una riduzione della struttura secondaria dei fili
della mascherina alla temperatura elevata usata per l'estensione più
superelegante. Il limite superiore di formato per
l'amplificazione della polimerasi del frammento di Klenow era soltanto
circa 400bp. La polimerasi di Taq ed altre polimerasi
termostabili hanno sintetizzato i frammenti fino a 10 Kb (1.7.12.13). La disponibilità della polimerasi di Taq egualmente notevolmente ha facilitato
l'automazione della reazione poichè è un'operazione molto più
facile costruire un apparecchio che ciclerà un tubo di reazione con
le temperature differenti che produrre un dispositivo che
realizzerebbe sia thermocycling che l'aggiunta delle aliquote degli
enzimi. Attualmente ci è commercialmente una varietà
grande di thermocyclers disponibili. Questo sviluppo è
stato un fattore significativo nell'applicazione veloce di questa
tecnologia dalla Comunità scientifica (7).
Oltre che la produzione dei frammenti
double-stranded e smussato-conclusi del DNA che possono essere
costituiti da PCR, altre due caratteristiche del PCR progettano
contribuiscono notevolmente al programma di utilità di PCR. In primo luogo, la posizione del grippaggio degli
iniettori definisce i contorni del frammento amplificato e quindi il
requisito molecolare anteriore della clonazione dei luoghi di
riconoscimento del endonuclease di limitazione non è richiesto per
PCR. Poichè soltanto un numero limitato di sequenze del
DNA è luoghi di limitazione, PCR notevolmente aumenta la
flessibilità della scelta del formato e della composizione del
frammento. Secondariamente, non è necessario per i
oligonucleotides di PCR da essere esattamente complementare al DNA
della mascherina. “Le code” possono essere
aggiunte all'estremità’ 5 dell'iniettore per introdurre
le sequenze all'interno dei luoghi di innesco che possono essere
sfruttati così per introdurre i luoghi di riconoscimento del
endonuclease di limitazione o altre sequenze utili quali le mutazioni
nel DNA amplificato. Questo i fenomeni hanno permesso
l'emersione di PCR come metodo per la clonazione veloce del DNA
(1.7.13).
La clonazione molecolare ha tratto beneficio
dall'emersione di PCR come tecnica. La clonazione
diretta in primo luogo è stata condotta usando un frammento del DNA
di 110 B.P. amplificato da PCR e gli iniettori del oligonucleotide che
hanno contenuto i luoghi di riconoscimento del endonuclease di
limitazione hanno aggiunto alle loro 5’ estremità. Questi luoghi sono stati usati per facilitare la
clonazione del DNA amplificato M13 in un plasmide (17). Il frammento di 110 B.P. egualmente è stato ordinato
per confermare che questo metodo era un metodo veloce tuttavia certo a
clonazione. (figura 5)
La clonazione cell-based del DNA coinvolge la
replica del DNA in vivo, che
è associata con una fedeltà molto alta di copiatura a causa della
correzione delle bozze dei meccanismi. Tuttavia, quando
il DNA è ripiegato in vitro come con PCR, il tasso di errore di copiatura è
considerevolmente più grande. La polimerasi il più
ampiamente usata, la polimerasi del DNA di Taq tuttavia, non ha exonuclease
collegato’3 -’ 5 da conferire una funzione
di correzione delle bozze. Così il tasso di errore
dovuto il misincorporation basso durante la replica del DNA è
piuttosto alto per Taq:
per un 1 Kb ordini che ha subito 20 cicli efficaci di
duplicazione, circa 40% in serie di nuovi fili del DNA sintetizzato da
PCR che usando questo enzima conterrà un nucleotide errato derivando
da un errore di copiatura (16). Di conseguenza, anche se
la reazione di PCR coinvolge l'amplificazione di sola sequenza del
DNA, il prodotto finale sarà una miscela quasi della corrispondenza,
ma sequenze non identiche del DNA. Malgrado gli errori
dovuto la replica in vitro,
ordinare del DNA del prodotto totale di PCR può dare la sequenza
corretta data che l'incorporazione delle basi errate è essenzialmente
casuale ed il contributo di una base errata su uno o più fili è
soprafato tramite i contributi dalla maggioranza enorme dei fili che
avranno la sequenza corretta. Tuttavia, se il prodotto
di PCR deve essere clonato in cellule, parecchio l'individuo clona
può avere bisogno di di essere ordinato per determinare la sequenza
corretta (di consenso), prima di esperimenti ulteriori di condotta.
Più recentemente, il problema di infidelity della replica del
DNA durante la reazione di PCR è stato ridotto considerevolmente
usando le polimerasi termostabili alternative del DNA che hanno
associato l'attività’ di exonuclease 3’ -
5. Le polimerasi del DNA di
furiosusdi Pyrococcus(Pfu) e Thermococcus
Litoralis (SFIATO) stanno diventando più
ampiamente hanno usato a causa della correzione delle bozze conferita
da attività del loro exonuclease’ collegato 3’ - 5 (18). Il prodotto risultante di PCR di
Pfu per esempio, ha un molto livello più basso delle mutazioni
introdotte copiando gli errori: per un segmento del 1 Kb di DNA
che ha subito 20 cicli efficaci di duplicazione, circa 3.5% del DNA si
incagliano nel prodotto trasportano una base alterata (16).
I nuovi metodi per migliorare la specificità
sono stati sviluppati hanno basato sul riconoscimento che la
polimerasi del DNA di Taq mantiene bene l'attività enzimatica
considerevole alle temperature sotto l'optimum per la sintesi del DNA. Quindi, gli iniettori che temprano non-specifically ad
una regione incagliata parzialmente singola della mascherina possono
essere estesi prima che la reazione raggiunga 72°C per l'estensione
degli iniettori specificamente temprati. Se la
polimerasi del DNA è attivata solo dopo che la reazione ha raggiunto
le alte (> 70°C) temperature, l'amplificazione dell'non-obiettivo può
essere minimizzata (19.20). Questo “metodo
di inizio” caldo può essere compiuto tramite l'aggiunta
manuale di un reagente essenziale al tubo di selezione alle
temperature elevate. L'aggiunta della proteina
obbligatoria di ssDNA egualmente è stata segnalata per aumentare
l'amplificazione specifica. Un metodo più facile da
usare deve usare l'inibizione o l'inattivazione della polimerasi del
DNA in se. Due tipi di inibizioni di polimerasi del DNA
di Taq sono stati provati compreso inibizione del oligonucleotide (21)
ed inibizione dell'anticorpo (22). Gli inibitori altamente
specifici del oligonucleotide di entrambe le polimerasi del DNA di
Taq sono stati prodotti. Questi inibiscono
selettivamente l'attività della polimerasi del DNA alle temperature
sotto 40°C e sono stati indicati alla funzione nelle applicazioni di
inizio caldo. Alternativamente, uno può usare un
anticorpo contro la polimerasi del DNA di Taq. L'anticorpo
inibisce la polimerasi del DNA fino a che la temperatura del PCR non
sia tale che l'anticorpo è denaturato ad una temperatura più grande
di 55°C, quindi liberante l'enzima. Per quanto ci sono
svantaggi a questo tipo di stati di inizio caldo. In
questo caso, uno ha bisogno di un anticorpo per ogni enzima differente
usato in un PCR e per tantissimo PCRs questo può aumentare
significativamente costi. La forma più conveniente
dell'inizio caldo deve modificare la polimerasi del DNA im modo tale
che è inattiva alla temperatura ambiente (mutante
temperatura-sensibile) e soltanto è riattivata dopo incubazione a
95°C per 6-15 minuti (23).
A causa della relativa semplicità, PCR è una
tecnica popolare con una vasta gamma delle applicazioni
compreso ordinare diretto, clonazione genomic, DNA che
digitano, rilevazione dei microorganismi contagiosi, mutagenesi
luogo-diretta, ricerca genetica prenatale di malattia ed analisi delle
variazioni allelic di sequenza (1.7.13.16) che dipende da
essenzialmente tre vantaggi importanti del metodo:
Velocità e facilità di uso: La
clonazione del DNA da PCR può essere effettuata in un tempo
relativamente corto, in alcune ore. Solitamente, una
reazione di PCR consiste di intorno 30 cicli ogni ciclo che contiene
una denaturazione, la sintesi e reannealing il punto, con un ciclo
specifico che occorre tipicamente 3
5 minuti in un
cycler termico automatizzato. Ciò è chiaramente più
rapida del tempo richiesto per la clonazione cell-based del DNA, in
grado di occorrere le settimane di tempo. Ancora, è
abbastanza facile da installare una reazione di PCR e l'uso di una
macchina del thermocycler è egualmente facile. Un certo
tempo è richiesto per la progettazione e la sintesi degli iniettori
del oligonucleotide, ma questo è stato facilitato dalla
disponibilità del software di calcolatore per il disegno più
superelegante e dalla sintesi commerciale o accademica veloce dei
oligonucleotides su ordinazione. L'ottimizzazione degli
stati di PCR può essere richiesta quali la temperatura più
superelegante di ricottura, la concentrazione nel magnesio e la
concentrazione più superelegante. Tuttavia, la
creazione delle macchine di pendenza PCR che permettono che una
varietà di temperature più supereleganti di ricottura sia esaminata
allo stesso tempo notevolmente ha fatto diminuire il tempo richiesto
per questo punto. I termini ottimali per una reazione
sono stati ottenuti una volta, la reazione possono allora essere
ripetuti semplicemente (1.7.13.16).
Sensibilità: PCR è capace di
amplificazione delle sequenze dagli importi minuscoli del DNA
dell'obiettivo, persino il DNA da una cellula (24). Tale
sensibilità squisita si è permessa i nuovi metodi di studiare la
patogenesi molecolare ed ha trovato le applicazioni numerose nella
scienza legale, nella diagnosi, nell'analisi genetica del collegamento
usando lo singolo-sperma che digita e negli studi molecolari di
paleontologia, dove i campioni possono contenere i numeri minuscoli di
cellule. Tuttavia, la sensibilità estrema del metodo significa
che la cura grande deve essere presa per evitare la contaminazione del
campione in esame da DNA esterno, quali dagli importi minuscoli delle
cellule dall'operatore (1.7.13.16).
Robustezza: Una vasta gamma di
sorgenti dell'acido nucleico è mascherine adatte per l'amplificazione
di PCR. DNAs purificato dalla varia specie e le sorgenti
sono stati amplificati. PCR può consentire
l'amplificazione delle sequenze specifiche da materiale in cui il DNA
male è degradato o incastonato in un media da cui l'isolamento
convenzionale del DNA è problematico. Di conseguenza, è ancora
molto adatto ad antropologia molecolare e la paleontologia studia, per
esempio l'analisi di DNA recuperata dal remains archaeological.
Egualmente è stata usata con successo per amplificare il DNA da
formalina-fisso o i campioni paraffina-incastonati del tessuto, che ha
applicazioni importanti nella patologia molecolare e, in alcuni casi,
nel collegamento genetico studia. Generalmente, il
successo dell'amplificazione di PCR è più grande quando i frammenti
dell'obiettivo sono relativamente abbondanti (1.7.13.16).
Malgrado la relativa popolarità enorme, PCR
presenta determinate limitazioni come metodo per selettivamente la
clonazione delle sequenze specifiche del DNA.
Per costruire gli iniettori specifici del oligonucleotide che
consentono l'amplificazione selettiva di una sequenza particolare del
DNA, alcune informazione anteriori di sequenza sono necessarie
solitamente. Ciò significa normalmente che la regione
del DNA di interesse è stata caratterizzata parzialmente
precedentemente, clonazione cell-based anteriore spesso seguente del
DNA. Tuttavia, una varietà di metodi è stata
sviluppata che riducono o persino escludono il fabbisogno di
informazioni anteriori di sequenza del DNA riguardo al DNA
dell'obiettivo. Le sequenze precedentemente atipiche del
DNA possono a volte essere clonate usando PCR con i oligonucleotides
degenerati se sono membri di un gene o famiglia ripetuta almeno una
del DNA di cui dei membri precedentemente è stato caratterizzato. In alcuni casi, PCR può essere usato efficacemente
senza alcune informazioni anteriori di sequenza riguardo al DNA
dell'obiettivo per consentire il indiscriminateamplification delle
sequenze del DNA da una sorgente di DNA che è presente in quantità
extemely limitata. Di conseguenza, anche se PCR può
essere applicato per accertare l'amplificazione intera del genome, non
presenta il vantaggio della clonazione cell-based del DNA nell'offerta
del modo di separazione del DNA specifico clona contenere una libreria
genomic del DNA.
La quantità di prodotto di PCR ottenuta in singola reazione è
anche molto limitata di l'importo che può essere ottenuto usando la
clonazione cell-based in cui regoli -in su dei volumi delle colture
delle cellule è possibile. Il risparmio di temi di una reazione
di PCR varierà dalla mascherina alla mascherina e secondo i vari
fattori che sono richiesti per ottimizzare la reazione ma in genere
soltanto gli importi comparativamente piccoli del prodotto sono
realizzati.
Anche se il rendimento teorico di PCR è esponenziale, il
rendimento reale di un PCR molto più di meno sta indicando che lo
schema sta funzionando con di meno che il relativo potenziale massimo. Per esempio, la quantità di prodotto ad ogni ciclo
finalmente stabilizza. Questo plateau può essere
spiegato dai seguenti fenomeni. In primo luogo, alcuna
della mascherina può mai essere disponibile dovuto le rotture del
filo o il guasto del DNA al dissociato a da altre macromolecole
durante purificazione ed i thermocycles iniziali. Secondariamente, la quantità di enzima è limitata e
finalmente l'attività può diminuire. In terzo luogo,
poichè la concentrazione del prodotto double-stranded raggiunge i
livelli elevati, la concorrenza aumenta fra la ricottura della
mascherina (prodotto di PCR) all'iniettore e del reannealing dei fili
complementari della mascherina (1.7.13).
Uno svantaggio grande volte di molte ed evidente di PCR come
metodo della clonazione del DNA è stato l'intervallo di grandezza
delle sequenze del DNA che possono essere clonate. Diverso della clonazione cell-based del DNA in cui il
formato delle sequenze clonate del DNA può avvicinarsi al mb 2,
segnalata le sequenze del DNA clonate da PCR sono stati tipicamente
nei 0.1
5 Kb di intervallo di grandezza, spesso
all'estremità più inferiore di questa scala. I piccoli
frammenti di DNA possono essere amplificati solitamente facilmente da
PCR, comunque diventa sempre più più difficile da ottenere
l'amplificazione efficiente mentre la lunghezza voluta del prodotto
aumenta. Barnes (25) ha riconosciuto una limitazione di
lunghezza dell'obiettivo all'amplificazione di PCR di DNA. Ha usato una combinazione di un livello elevato di un
exonuclease-libero, mutante di omissione del N-terminale della
polimerasi del DNA di Taq, Klentaq1, con un livello molto basso di una
polimerasi termostabile del DNA che esibisce 3'-exonuclease
un'attività (Pfu, sfiato, o sfiato profondo) per condurre lungamente
l'alta fedeltà PCR. Almeno 35 Kb del batteriofago lambda
possono essere amplificati agli alti rendimenti da 1 NG della
mascherina del DNA di lambda. L'uso di questo metodo ha
reso la fedeltà aumentata di base-accoppiamento, la capacità usare i
prodotti di PCR come iniettori ed il rendimento massimo del frammento
dell'obiettivo. Altre circostanze sono state
identificate per l'amplificazione efficace degli obiettivi più
lunghi, compreso l'amplificazione di fino a 22 Kb di beta-globin serie
di ingranaggi del gene da DNA genomic umano e di fino a 42 Kb dal DNA
di phaga lambda (26). I termini per questi PCRs lunghi
hanno incluso il pH aumentato, aggiunta di glicerolo e di solfossido
dimetilico, diminuita tempi di denaturazione, aumentata tempi di
estensione e l'uso di una polimerasi termostabile secondaria del DNA
che possiede un 3'-to 5'-exonuclease, o "di correzione delle bozze,"
attività. "il protocollo di PCR lungo" ha effettuato la
specificità richiesta per gli obiettivi in DNA genomic usando i più
bassi livelli della polimerasi e gli stati del sale e di temperatura
per la ricottura specifica dell'iniettore. La
capacità di amplificare lle sequenze del DNA di 10-40 Kb porterà la
velocità e la semplicità di PCR al tracciato genomic e ad ordinare e
faciliterà gli studi nella genetica molecolare (26). Generalmente, i termini per lunga autonomia PCR
coinvolgono una combinazione delle modifiche ai termini standard con
un sistema della due-polimerasi. Ciò fornisce i livelli
ottimali di attività della polimerasi e di exonuclease’3 -’ 5 del DNA che serve da meccanismo di
correzione delle bozze (16).
Thermocyclers che regolano automaticamente
temperature per ciclare di PCR è stato introdotto in 1986 (figura 6). Oltre che gli avanzamenti in reagenti di PCR, i nuovi
strumenti per il thermal automatizzato che cicla e per analizzare i
prodotti di PCR sono stati sviluppati. I nuovi cyclers
termici hanno aumentato i tassi del heating, raffreddandosi e scambio
di calore nei vasi modificati di reazione. I vasi di
reazione accomodati dai cyclers termici della prima generazione (o
persino dai bagni dell'acqua e dai blocchetti del heating) erano tubi
di plastica standard del microfuge. L'amplificazione di
PCR in tubi capillari sottili ha permesso ciclare termico veloce e la
sintesi del DNA a 20s. La velocità dei mutamenti di
temperatura realizzati in questi sistemi ha permesso la definizione
precisa degli optimum di temperatura per ogni punto specifico nel
ciclo di PCR. I cyclers termici della nuova generazione
egualmente accomodano più campioni, hanno profili termici più
precisi e sono programmabili (13).
Uno dei meno contributi apprezzati
all'applicazione diffusa di PCR è stato lo sviluppo di chimica
automatizzata certa per la sintesi del oligonucleotide. Fino a poco tempo fa, la costruzione di singolo
oligonucleotide era un'operazione notevole che potrebbe essere
effettuata soltanto in un da un chimico organico esperto. Ora è possibile comprare il uno o il altro un
sintetizzatore del oligonucleotide che può essere funzionato da un
tecnico o dai oligonucleotides essi stessi a partire da una sorgente
commerciale o accademica. Le macchine multiple di
sintesi del oligonucleotide sono state costruite allo scopo di ridurre
il costo generale della sintesi (27.28). Come i
oligonucleotides definiscono i prodotti finali di PCR, non c'è dubbio
che in assenza del loro aspetti il rifornimento, PCR non
avrebbe goduto l'accettazione larga che avesse guadagnato oggi (13).
I ricercatori hanno accosentito nella fase
iniziale che la progettazione degli iniettori di PCR era difficile e
non fidata. I programmi destinati all'elaboratore sono
stati inventati per prendere tutti i test di verifica di disegno in
considerazione. Uno dei primi programmi scritti per il
disegno più superelegante era Olga che ha usato l'implementazione
della GEMMA di ricerca di Digital (gestore dell'ambiente dei grafici)
sulla st di Atari (29). Olga specificamente è stato
adatto alla reazione a catena della polimerasi (PCR) che permette
un'analisi simultanea di due sequenze più supereleganti. Il vantaggio di Olga era che ha fornito nelle analisi di
un programma per le ripetizioni dirette, le strutture secondarie e la
dimerizzazione più superelegante come pure parecchi strumenti utili
'di rifinitura 'per gli operai agganciati nelle sintesi di
ottimizzazione e del oligonucleotide di PCR. Il
programma Primer3 all'istituto di Whitehead ora si pensa per essere lo
strumento più certo e più versatile attualmente disponibile (30).
PCRs può ora essere effettuato permettendo
l'amplificazione dei frammenti del DNA fino a parecchi kilobases di
lunghezza entro più di un milione di volte la loro abbondanza
iniziale. La procedura è altamente automatable e
richiede appena alcune ore dal cominciare thermocyling ad analisi di
prodotto. Ciò non era precedentemente il caso ed i
requisiti pratici dell'effettuazione del PCR notevolmente sono stati
facilitati dai primi manoscritti del metodo (13). Oggi,
la maggior parte dei legamenti iniziali o le inefficienze del PCR sono
stati risolti (8). Ancora, PCR si è espanso per
includere più di 270.000 articoli (31).
La reazione a catena della polimerasi è il metodo il più ampiamente usato per l'amplificazione in vitro del DNA tuttavia che richiede la denaturazione termica o thermocycling per separare i due fili del DNA. In vivo, il DNA è ripiegato dalle polimerasi del DNA con le varie proteine accessore. Il helicase del DNA, proteine accessore della polimerasi del DNA si comporta per separare il DNA duplex all'interno delle cellule. Vincent ed altri. (32) ha inventato un nuovo metodo isotermico in vitro di amplificazione del DNA imitando il meccanismo in vivo della replica. l'amplificazione Helicase-dipendente (HDA) utilizza un helicase del DNA per generare le mascherine singolo-incagliate per l'ibridazione più superelegante. L'estensione successiva dell'iniettore allora è catalizzata da una polimerasi del DNA. HDA non richiede un thermocycler costoso e PCR può essere effettuato così praticamente dovunque. In più, offre parecchi vantaggi sopra altri metodi isotermici di amplificazione del DNA avendo uno schema semplice di reazione ed essendo una vera reazione isotermica che può essere effettuata ad una temperatura per l'intero processo. HDA offre la promessa grande nello sviluppo dei dispositivi diagnostici portatili semplici del DNA essere usato nel campo ed alla punto-de-cura (32).
Si dice che il modo più semplice e più
conveniente definire PCR è come tecnica. Tuttavia, una tal categorizzazione elimina
la storia di sviluppo di PCR's altretanti individui nel corso degli
anni contribuiti alle idee dietro la teoria di PCR e la
fine-sintonizzazione della tecnica. La risposta più
semplice seguente deve chiamare un individuo come l'inventore della
reazione a catena della polimerasi. Karry Mullis ha
ricevuto il premio Nobel per chimica in 1993 per la sua scoperta di
PCR. Tuttavia, questa scoperta è contestata fra molti
scienziati, che possono contribuire a sbloccare questo puzzle.
Egualmente si è detto che PCR non ha esistito fino a farlo
funzionare esso in un sistema sperimentale. Con
l'intenzione, soltanto il pensiero di un concetto non è sufficiente;
un concetto deve essere messo con successo in pratica (33).
Anche se ci è dubbio quanto all'ultimo creatore di PCR e dubbio
quanto alla possibilità che PCR può in qualche modo o un momento
essere sostituito, ci è piccolo dubbio l'effetto che PCR ha creato
sopra un periodo corto sullo studio su biologia e su vita molecolari.
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