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Espressione Recombinant Della Proteina

Stazione © Molecolare 2006 Del Copyright

Quando desiderate caratterizzare un gene o una proteina di interesse, dovete in primo luogo studiare la relativa funzione. In questa era molecolare, ottenere un DNA del vostro gene di interesse non è difficile.

Per esprimere il DNA come proteina, lo IE una proteina recombinant, una può allora svolgere facilmente gli studi funzionali usando la proteina purificata recombinant.

Una volta che avete una proteina purificata potete condurre:

• Esperimenti Di Interazione Della Proteina-proteina
• Cinetica Degli Enzimi
• Studi funzionali della proteina
• Studi strutturali - compreso cristallizzazione della proteina, la struttura della proteina e RMN.
• Potete anche usare la proteina per preparare gli anticorpi per ulteriori esperimenti.

Ci sono due sistemi principali per l'espressione di proteina recombinant. Una volta che ottenete il vostro DNA clonato, dovete decidere dove desiderate amplificare la vostra proteina. Ciò sarà (solitamente un sistema prokaryotic (batterico) o eukaryotic della cellula di mammiferi o del lievito). La scelta del vostro sistema deciderà quale vettore dovrete clonare il vostro DNA poichè ci sono promotori differenti che funzionano in E.Coli ed altri che funzionino il più bene con lievito o i sistemi mammiferi.

Così che il sistema di espressione della proteina voi usano?

 Sistemi per l'espressione della proteina

Sistemi Di Espressione Della Proteina Di Prokaryotic

I sistemi recombinant di espressione della proteina di Prokaryotic presentano parecchi vantaggi. Questi includono la facilità di coltura ed il significato che molto veloce di sviluppo delle cellule non dovrete attendere lungamente per ottenere la proteina dai sistemi batterici una volta che clonate il vostro DNA. L'espressione può essere indotta facilmente nei sistemi batterici di espressione della proteina usando IPTG. Inoltre, la purificazione è abbastanza semplice nei sistemi prokaryotic di espressione e ci è una pletora di kit commerciali disponibili per l'espressione recombinant della proteina.

D'altra parte, se dovete usare le vostre proteine per gli studi funzionali o enzimatici i sistemi prokaryotic sono un problema mentre la maggior parte delle proteine diventano insolubili nei corpi dell'inclusione e sono molto difficili da recuperare come proteine funzionali. Ancora, la maggior parte se non tutte le modifiche alberino-post-translational non sono aggiunti dai batteri e quindi la vostra proteina di interesse non può essere funzionale. Gli studi enzimatici così possono essere unfruitful.

Sistemi Di Espressione Di Eukaryotic

I geni di Eukaryotic non sono realmente “nel paese” in cellule prokaryotic, anche quando sono espressi sotto il controllo dei vettori prokaryotic.  Un motivo è che le cellule del E. coli frequentemente riconoscono i prodotti della proteina dei geni eukaryotic clonati come stranieri e li distruggono.  Un altro è che i prokaryotes non effettuano gli stessi generi di modifica di posttranslational come gli eucarioti.  Per esempio, una proteina che ordinariamente sarebbe accoppiata agli zuccheri in una cellula eukaryotic sarà espressa come proteina nuda una volta clonata in batteri.  Ciò può effettuare un'attività’o una stabilità della proteina s, o almeno la relativa risposta agli anticorpi.  Un problema più serio è che l'interiore di una cellula batterica non è come tendente alla piegatura adeguata delle proteine eukaryotic come l'interiore di una cellula eukaryotic.  Frequentemente, il risultato è piegato impropriamente, prodotti inattivi dei geni clonati. 

I sistemi di Eukaryotic per l'espressione di proteina includono:

• lievito
• cellule di mammiferi
• cellule di baculovirus (insetto)

Tutti questi sistemi sono sistemi eukaryotic grandi per l'espressione delle proteine recombinant.
I vantaggi dei sistemi eukaryotic di espressione della proteina includono il fatto che potete ottenere i livelli elevati molto dell'espressione. Le proteine sono facili da purificarsi usando le modifiche speciali che sono incluse nei vettori compreso suo, Myc ed altre modifiche.

Potete persino comprare i plasmidi che secernono la vostra proteina nei media. Di conseguenza potete continuare a sviluppare il vostro sistema e raccogliere i media senza lysing le vostre cellule. Non ci sono corpi dell'inclusione da preoccuparsi circa e le vostre proteine hanno modifiche alberino-post-translational intatte. Questi sono vitali se state studiando la funzione delle interazioni della proteina-proteina e/o della proteina.

Gli svantaggi dei sistemi eukaryotic di espressione della proteina includono il fatto che le cellule eukaryotic si sviluppano più lente delle cellule prokaryotic.

Vettori di espressione con i promotori forti

La funzione principale di un vettore di espressione è rendere solitamente il prodotto di un gene, più il prodotto il migliore.  Di conseguenza, i vettori di espressione ordinariamente sono dotati dei promotori molto forti; la spiegazione razionale è che più mRNA è prodotto, più il prodotto della proteina sarà fatto.
Un tale promotore forte è il promotore del trp (operon del triptofano).  Costituisce la base per parecchi vettori di espressione, compreso ptrpL1.  Fa una regione del trp promoter/operator seguire, da un luogo obbligatorio del ribosoma e può essere usato direttamente come vettore di espressione inserendo un gene straniero nel luogo di ClaI. Alternativamente, la regione di controllo del trp può essere resa “portatile” tagliandolo fuori con ClaI e HindIII ed inserendolo davanti un gene da esprimere in un altro vettore

Vettori Viscoelastici Di Espressione

È solitamente conveniente mantenere un gene clonato represed fino a che non siamo aspettiamo per esprimerli.  Un motivo è che le proteine eukaryotic prodotte in grande quantità in batteri possono essere tossiche.  Anche se queste proteine non sono realmente tossiche, possono aumentano fino ai livelli grandi de Auch che interferiscono con sviluppo batterico.  In il uno o il altro caso, se il gene clonato fosse permesso rimanere acceso costantemente, i batteri che sopportano il gene non diventerebbero mai una concentrazione abbastanza grande per produrre le quantità espressive di prodotto della proteina.  La soluzione deve mantenere il gene clonato spento disponendolo a valle di un promotore viscoelastico che può essere spento.
Il promotore della bacca è viscoelastico fino a un certo punto, presumibilmente restante fuori fino allo stimolato a dal isopropylthiogalactoside sintetico dell'induttore (IPTG).  Tuttavia, la repressione causata dal repressor della bacca è incompleta e una certa espressione del gene clonato sarà osservata anche in assenza dell'induttore.  Il one-way intorno a questo problema deve esprimere il nostro gene in un plasmide o in un phagemid che trasporta il relativo proprio gene di lacI, come i pBS.  Il repressor eccedente ha prodotto da tali conservazioni di vettore il nostro gene clonato spento fino a che non fossimo aspettassimo per indurli con IPTG.
Un'altra strategia è di usare un promotore strettamente gestito come λ il promotore dei fagi PL. I vettori di espressione con questo sistema di promoter/operator sono clonati nelle cellule ospiti che sopportano un gene λ temperatura-sensibile del repressor (c1857).  Finchè manteniamo la temperatura di queste cellule relativamente bassa (32°C), il repressor funziona e nessun'espressione avviene.  Tuttavia, quando solleviamo la temperatura al livello nonpermissive (42ºC), il repressor temperatura-sensibile possono più non funzionare ed il gene clonato è indotto.

Vettori di espressione che producono le proteine di fusione

Quando la maggior parte dei vettori di espressione funzionano, producono le proteine di fusione.  Ciò potrebbe inizialmente sembrare uno svantaggio perché il prodotto naturale del gene inserito non è fatto.  Tuttavia, gli amminoacidi supplementari sulla proteina di fusione possono essere un aiuto grande nella purificazione del prodotto della proteina.

Consideri i vettori di espressione dell'oligo-istidina, uno di cui ha i pTrcHis di denominazione commerciale.  Questi hanno una sequenza corta appena controcorrente dal luogo multiplo della clonazione che mette una stirata in codice di sei istidine.  Quindi, una proteina espressa in un tal vettore sarà una proteina di fusione con sei istidine alla relativa estremità amminica.  Perchè desidereremmo fissare sei istidine alla nostra proteina?  le regioni dell'Oligo-istidina come questa hanno un'alta affinità per i metalli come nichel, in modo da possiamo purificare le proteine che hanno tali regioni usando la cromatografia di affinità del nichel.  La bellezza di questo metodo è la relative semplicità e velocità.  Dopo che i batteri facciano la proteina di fusione, lyse semplicemente loro, aggiungiamo l'estratto batterico dello srude ad una colonna di affinità del nichel, laviamo fuori tutte le proteine non legate, quindi liberiamo la proteina di fusione con istidina o un imidazolo chiamato analog dell'istidina.  Questa procedura permette che noi raccogliamo essenzialmente la fusione pura a soltanto un punto.  Ciò è possibile perché molto poco se delle proteine naturali hanno regioni dell'oligo-istidina, in modo da la nostra proteina di fusione è essenzialmente quello unico che si lega alla colonna.

Che cosa se desideriamo il nostro senza proteine della modifica dell'oligo-istidina? 

I progettisti di questi vettori hanno fornito meditatamente un modo rimuoverlo.  Appena prima il luogo multiplo della clonazione, ci è una regione di codificazione per una stirata degli amminoacidi riconosciuti dal enterokinase proteolitico degli enzimi.  Così possiamo usare il enterokinase per fendere la proteina di fusione in due parti:  la modifica dell'oligo-istidina e la proteina che desideriamo. Il luogo riconosciuto dal enterokinase è molto raro e la probabilità che esiste in nostra proteina è insignificante.  Quindi, la nostra proteina non dovrebbe essere tagliata su mentre stiamo rimuovendo la relativa modifica dell'oligo-istidina.  Se desideriamo, possiamo fare funzionare la proteina enterokinase-fenduta attraverso la colonna del nichel una volta di più per separare i frammenti di oligo-hisitidine dalla proteina di interesse.

λ i fagi egualmente hanno servito da base per i vettori di espressione;  uno progettato specificamente a questo fine è λgt11.  Questo fago contiene una regione di controllo della bacca seguita dal gene del lacZ.  I luoghi della clonazione sono situati all'interno del gene del lacZ, in modo da i prodotti di un gene inserito in questo vettore saranno proteine di fusione con un capo di B-galattosidasi.
Il vettore gt11 λdi espressione si è transformato in in un veicolo popolare per fare e selezionare le librerie del DNA.  λgt11 permette che noi selezioniamo un gruppo di clona direttamente per l'espressione della proteina di destra.  Gli ingredienti principali richiesti per questa procedura sono libreria del DNA λin gt11 e un antisiero diretto contro la proteina di interesse.
Placchiamo i nostri λ fagi con i vari inserti del DNA e macchiamo le proteine liberate da ogni clone su un supporto quale nitrocellulosa.  Una volta che abbiamo trasferito le proteine da ogni piastra a nitrocellulosa, sondiamo con il nostro antisiero.  Dopo, cerchiamo l'anticorpo limitato a proteina da una piastra particolare, usando la proteina identificata A dallo stafilococco aureo.  Questa proteina si lega strettamente all'anticorpo ed identifica il punto corrispondente sulla nitrocellulosa.  Rileviamo questa etichetta da autoradiografia o phosphorimaging, allora andiamo alla nostra piastra matrice e selezioniamo la piastra corrispondente.  Si noti che noi stanno rilevando una proteina di fusione, non la proteina di interesse in se.  Ancora, non importa se abbiamo clonato un DNA intero oppure no.  Il nostro antisiero è una miscela degli anticorpi che reagiranno con varie parti della nostra proteina, così persino un gene parziale farà, finchè la relativa regione di codificazione è clonata nello stesso telaio della lettura e di orientamento di la regione di codificazione della B-galattosidasi.

Per una revisione recombinant rapida di espressione della proteina veda:

Sistemi Recombinant Della Proteina

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