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Ibridazione della membrana per selezionare una libreria

Librerie della selezione usando ibridazione della membrana

Nelle circostanze della temperatura e della concentrazione nello ione trovate in cellule, il DNA è effettuato in una struttura (due-incagliata) duplex dai legami dell'idrogeno che la forma betwen le basi di T e di A e le basi di C e di G in ogni filo. I duplex del DNA possono essere denaturati nei singoli fili riscaldandoli, solitamente in una soluzione salina diluita (per esempio, un NaCl da 0.01 m.), o sollevando il pH superiore a 11. Se la temperatura è abbassata e la concentrazione nello ione nella soluzione è sollevata, o se il pH è abbassato alla riforma bassa di accoppiamenti di GASCROMATOGRAFIA ed A, di neutralità fra i singoli fili complementari.

Questo processo va da molti nomi: renaturation, riassociazione, ibridazione, temprante. In una miscela degli acidi nucleici, soltanto i singoli fili complementari (o fili che contengono le regioni complementari) si riassoceranno; il limite della loro riassociazione è virtualmente inalterato dalla presenza dei fili noncomplementary. Tale ibridazione molecolare può avvenire fra due fili complementari di DNA o di RNA, o fra un filo del RNA e un filo del DNA. Utilizzare l'ibridazione molecolare nella rilevazione di DNA specifico clona, singolo DNA incagliato dalle molecole recombinant del DNA è fissata ad un supporto solido, comunemente un filtro della nitrocellulosa o una membrana di nylon trattata. Quando una soluzione che contiene gli acidi nucleici di single0stranded è asciugata su una tal membrana, i singoli fili sono irreversibilmente limitati al supporto solido in un modo che fogli più delle basi disponibili per l'ibridazione ad un filo complementare. Anche se la chimica se questo grippaggio irreversibile non è capito buono, la procedura è molto utile. La membrana allora è incubata in una soluzione che contiene il DNA singolo-incagliato radioattivo identificato (o RNA) che è complementare ad alcuno dell'acido nucleico limitato alla membrana.

Nelle circostanze di ibridazione (vicino a pH neutro, 40-65 C, un NaCl da 0.3-0.6 m.), questa sonda identificata ibrida all'acido nucleico complementare limitato alla membrana. Tutta la sonda eccedente che non ibrida è lavata via e gli ibridi identificati è rilevata da autoradiografia del filtro. I virions recombinant di lamda presenti in piastre di un prato del E. coli sono trasferiti ad una membrana di nylon disponendo la membrana sulla superficie della capsula di Petri. Molte delle particelle virali in ogni piastra assorbono alla superficie della membrana, ma molti virions rimangono nelle piastre sulla superficie dell'agar nutriente nella capsula di Petri che contiene tantissimo lamda specifico clona è riprodotto sulla superficie della membrana.

La capsula di Petri di originale è refrigerata per memorizzare l'accumulazione del lamda clona. La membrana allora è incubata in una soluzione alcalina, che interrompe i virions, liberanti e denaturanti il DNA incapsulato. La membrana allora è asciugata, riparante il DNA recombinant di lamda alla superficie della membrana. Dopo, la membrana è incubata con una sonda radioattiva nelle circostanze di ibridazione. La sonda di Unhybridized è lavata via ed il filtro è sottoposto ad autoradiografia.

Il appearence di un punto sul autoradiogram indica la presenza di un clone recombinant di lamda che contiene il DNA complementare alla sonda. La posizione del punto sul autoradiogram corrisponde alla posizione sulla capsula di Petri originale in cui quel clone particolare ha formato una piastra. Poiché la capsula di Petri originale ancora contiene molti virions di infectioua in ogni piastra, le particelle virali dal clone identificato possono essere recuperate per la sostituzione allineando il autoradiogram e la capsula di Petri e rimuovendo le particelle virali dal clone che corrisponde al punto. Una tecnica simile può essere applicata per selezionare una libreria del plasmide in cellule di E.coli.