Benvenuto alla stazione molecolare!

Dovete registrare prima che possiate inviare sulle nostre tribune o usare le nostre caratteristiche avanzate. Registro Ora! Il relativi libero e veloce!

Già registrato? Inizio attività ora sotto.

Nome Dell'Utente:

Parola d'accesso:

Selo ricordi di?

Già registrato ed ha dimenticato la vostra parola d'accesso? Scatto qui sotto per recuperarlo.

Recuperi La Parola d'accesso Persa

Ora uniscasi - è veloce e libera!

La stazione molecolare è la più grande rete dei ricercatori, degli scienziati e degli amanti di scienza dovunque!

Alberini Recenti Della Tribuna

Spettrometria Totale

Che cosa è uno spettrometro di massa?

Uno spettrometro di massa è basato sul fatto semplice che i prodotti chimici differenti hanno masse differenti e questo è che cosa determina che prodotti chimici sono presenti in un campione. Ci sono molti tipi di spettrometri di massa che non soltanto analizzare diversamente gli ioni ma produrre i tipi differenti di ioni; tuttavia tutti usano campi elettrici e magnetici cambiare il percorso degli ioni in qualche modo.

Durante la fine degli anni 1980 e l'inizio degli anni 90, due nuovi metodi di ionizzazione del campione hanno indotto la spettrometria totale a subire un giro nell'analisi del biopolimero, vale a dire ESI 38 e MALDI.39 appena sopra una decade fa, per la prima volta, tecniche spettrometrihe della massa che potrebbero misurare le masse molecolari di quantità del femtomole di proteine al di sopra del kDa 100, migliorare spesso che 0.01% esattezze, è diventato ampiamente disponibile ai chimici della proteina. Questi metodi riescono entrambe il in formare gli ioni dalle grandi, biomolecole labili senza degradazione significativa del analyte. Sono non soltanto entrambe le tecniche sensibili ma di sequenza veloce – di MS/MS che anche gli spettri sia della MS possono essere acquistati nei secondi. ESI e MALDI, dovuto le loro molte differenze, sono complementari e molti laboratori del biopolimero hanno accesso ad entrambe le tecniche.

Preparazione del campione: elettroforesi 2-Dimensional e spettrometria totale

La separazione, l'isolamento e la preparazione del campione per le tecniche spettrometrihe totali generalmente, coinvolge 2-DE (2-Dimenisional elettroforesi), una tecnica che può separare l'altretanto come 5000 proteine differenti in un singolo esperimento. In generale, 2-DE è capace di separazione delle proteine all'interno di una gamma isoelettrica del punto (pi) di 3.5–10 e di masse molecolari che variano da 6 al kDa 300, come pure potendo distinguersi fra le proteine modificate alberino-translationally (per esempio fosforilato) ed i loro compagni non-modificati. Una volta che separate, le componenti proteiche sono rivelate mediante tecniche della coloritura (per esempio macchia d'argento, macchia fluorescente, azzurro di Coomassie) ed individuato una volta possono allora essere estratte dal gel. Le proteine non possono essere eluite facilmente dai gel senza l'uso dei detersivi, che sono nocivi all'analisi spettrometria totale; ulteriormente, le grandi proteine tendono ad essere eterogenee (per esempio come conseguenza del glycosylation) ed in modo da non possiede massa molecolare che possa essere collegata con l'entrata corrispondente in una base di dati. Per superare questi ostacoli, il punto di eluizione tende ad essere compiuto dopo che la proteina sia stata digerita da una lavata acquosa dell'acetonitrile di una parte asportata del gel. Ciò aumenta il rendimento dell'estrazione 5 ed usando un metodo di digestione del in-gel che impiega la tripsina, che è stata descritta ed ampiamente è usata come pubblicato o con le modifiche secondarie, produce un campione Ms-compatibile da cui un'identificazione della proteina può essere fatta. Il punto di digestione può essere preceduto da un punto facoltativo di alchilazione e di riduzione per fendere ed ostruire i ponticelli del bisolfuro che esistono fra i residui della cisteina. I sistemi robot sono stati sviluppati per automatizzare l'asportazione dei punti della proteina dal 2D-gel, per effettuare la digestione enzimatica successiva e trasferire i campioni su MALDI-MS designi le piastre come bersaglio per l'analisi iniziale della MS. Per molte applicazioni, i peptidi recuperati dalle digestioni del in-gel richiedono la concentrazione e la purificazione prima di essere analizzato tramite la spettrometria totale particolarmente se ESI è il metodo di ionizzazione impiegato. Liquido in controfase di rendimento elevato
la cromatografia (HPLC) è un metodo di realizzare questo; un altro metodo coinvolge l'uso materiale di aspersione di ZipTips (millipore) (punte della pipetta imballate con materiale C18) o di Poros R2 (biosistemi di Perseptive). Malgrado la relativa accettazione diffusa, le limitazioni di 2-DE includono l'esclusione di proteine molto piccole o molto grandi, di proteine molto silicee o molto di base, così come le proteine idrofobe quali le proteine della membrana. Si pensa quello
soltanto 20% delle proteine gel-caricate può essere visualizzato ed analizzato. Altri vincoli sono che la quantità di campione che può essere caricata è limitata causando il non-observance di
le proteine basse di concentrazione ed egualmente quello le tecniche della coloritura il più comunemente usate hanno fattori non lineari di risposta. In pratica, 2-DE è un processo intenso di lavoro che coinvolge i punti di movimentazione manuale che offrono l'opportunità per le impurità quale la cheratina di contaminare i campioni. Un 2-D gel occorrerà un giorno per completare e circa un mese per un'analisi strutturale completa dalla MS, anche se l'automazione può aiutare sia il problema di contaminazione che accelerare l'analisi in parte.

Tecniche alternative di separazione della proteina

L'alternativa, metodi Ms-compatibili di preparazione della proteina è in sviluppo ma nessuna tecnologia è emerso come rimontaggio universale. Questi metodi mirano generalmente a connettere il campione della proteina direttamente alle analisi di MS/MS quindi che eliminano i punti che richiede tempo della preparazione del campione e l'esigenza di un'analisi preliminare della MS. Messa a fuoco isoelettrica capillare (CIEF)-MS e la messa a fuoco isoelettrica preparatoria seguiti dalla cromatografia-Ms di esclusione di formato sono metodi che sono stati approfondito confrontato con 2-DE in termini di effciency di separazione, capienza peak, precisione e robustezza, con precedente comparire il alternative.The più favorevole dirigono l'analisi delle miscele complesse del peptide da una miscela delle proteine usando in linea, cromatografia a fase mobile liquida in controfase di rendimento elevato (HPLC)-MS/MS è stato usato con successo mentre un'alternativa a 2DE ed a questo ha condotto sulla cromatografia multidimensionale se la separazione più grande del peptide è desiderabile prima delle analisi di MS/MS. Gli esempi della cromatografia bidimensionale includono lo scambio cationico o dell'anione seguito dalla cromatografia in controfase di esclusione di formato e di HPLC seguita da HPLC in controfase. Un altro, metodo alternativo è stato di usare l'micro-estrazione in fase solida unita insieme al vaso capillare electrophoresis(CE) accoppiato a ESI MS/MS per l'analisi di una raccolta trittica della proteina totale. Questo metodo si è permesso la separazione di alta risoluzione dei frammenti del peptide permettendo l'identificazione di 80–90% delle proteine in questo complesso particolare del ribosoma del lievito. La coppia dei dispositivi microfluidic alla MS è una strategia ulteriore che unisce il maneggiamento e la separazione del campione, così come collegare mediante interfaccia ordinatamente al metodo differente della nano-ESI-Ms analysis.A per il frazionamento selettivo della proteina e l'identificazione usa la tecnologia di ProteinChip (Ciphergen) che impiega un metodo di superficie di bloccaggio usando gli anticorpi o le superfici chimicamente modificate per bloccare i codici categoria specifici delle proteine che allora sono analizzate da MALDI-MS. Questa tecnica, conosciuta come superficie ha aumentato la ionizzazione di dissorbimento del laser (SELDI)-MS35, ha potenziale grande per il confronto del contenuto proteico dei campioni differenti.