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Degradazione Automatizzata Di Edman

Le sequenze dell'amminoacido possono essere determinate da degradazione automatizzata di Edman

La composizione in amminoacidi del peptide è determinata.  Il peptide è idrolizzato nel relativo amminoacido costituente riscaldandolo in 6 la N HCl a 110°C per 24 ore.  Stanford Moore e William Stein hanno indicato che gli amminoacidi in idrolizzati possono essere separati dalla cromatografia dello ionexchange sulle colonne di sulfonated il polistirolo e quantificato reagendole con la ninidrina. 

Gli amminoacidi hanno trattato questo give di modo un colore blu intenso, tranne pralina, che dà un colore giallo perché contiene un gruppo amminico secondario.  La concentrazione di amminoacido in una soluzione è proporzionale alla capacità di assorbimento ottica della soluzione dopo il heating esso con ninidrina.  Questa tecnica può rilevare un microgrammo (10nmol) di un amminoacido, che è circa l'importo presente in un thumbprint. 

Così piccolo come un nanogram (pmol 10) di un amminoacido può essere rilevato per mezzo di fluorescamine, che reagisce con il gruppo un-amminico di un prodotto altamente fluorescente.  L'identità dell'amminoacido è rivelata dal relativo volume di eluizione, che nel volume dell'amplificatore ha usato eliminare l'amminoacido dalla colonna. 

Il residuo del amminico-terminale di proteina o di peptide può essere identificato identificandolo con un residuo che forma un collegamento covalente stabile. 

Fluorodinitrobenzene (FDNB) in primo luogo è stato usato a questo fine da Frederick Sanger.  Il cloruro di Dabsyl ora è usato comunemente perché forma i derivati intensamente colorati che possono essere rilevati con l'alta sensibilità.  Reagisce con un gruppo uncharged a-NH2 per formare un derivato del sulfamidico che è stabile nelle circostanze che idrolizzano i legami del peptide. 

Anche se il metodo di dabsyl per la determinazione del residuo del amminico-terminale è sensibile e potente, non può essere usato ripetutamente sullo stesso peptide perché il peptide completamente è degradato al punto di acido-idrolisi.  Pehr Edman ha inventato un metodo per identificare il residuo del amminico-terminale e fenderlo dal peptide senza interrompere il peptide lega fra gli altri residui dell'amminoacido.  La degradazione di Edman rimuove in sequenza un residuo alla volta dall'estremità amminica di un peptide.  L'isotiocianato fenilico reagisce con il gruppo amminico terminale uncharged del peptide per formare un derivato di phenylthiocarbamoyl.  Allora, nelle circostanze silicee mildy, un derivato ciclico dell'amminoacido terminale è liberato, che lascia un peptide intatto ridotto da un amminoacido.

Le analisi delle strutture della proteina contrassegnato sono state accelerate tramite lo sviluppo dei sequenators, che sono strumenti automatizzati per la determinazione della sequenza dell'amminoacido.  In un sequenator liquid-phase, una pellicola sottile di proteina in una tazza cilindrica di filatura è sottoposta alla degradazione di Edman.  I reagenti ed i solventi di estrazione sono passati sopra la pellicola immobilizzata di proteina e l'acido PTH-amminico liberato è identificato da cromatografia a fase mobile liquida ad alta pressione (anche chiamata cromatografia a fase mobile liquida, HPLC ad alto rendimento). 

Un ciclo della degradazione di Edman è effettuato in più meno di due ore.  Dalle degradazioni ripetute, la sequenza dell'amminoacido di circa cinquanta residui in una proteina può essere determinata.  I sequenators in fase gassosa possono analizzare le quantità di picomole di peptidi e di proteine.  Questa alta sensibilità lo rende fattibile per analizzare la sequenza di un campione della proteina eluito da una singola fascia di un gel del SDS-poliacrilammide.