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Alberini Recenti Della Tribuna

Digestione Degli Enzimi Di Limitazione

Enzimi Di Limitazione

©Stazione Molecolare 2006

Le informazioni su come transformarsi in in un esperto sugli enzimi di limitazione e sul DNA di digestione!

Priorità bassa sugli enzimi di limitazione

Gli enzimi di limitazione (o endonucleases di limitazione) sono enzimi che tagliano il DNA double-stranded facendo due rotture, uno con ciascuna delle basi del fosfato di doppia elica. L'enzima fa questo senza danneggiare le basi del DNA. Anche se l'enzima rompe il DNA, i legami chimici possono essere riformati da altri enzimi conosciuti come le ligasi del DNA. Di conseguenza, i frammenti di limitazione di DNA dai cromosomi o dai geni differenti possono legarsi insieme, fornendo le loro estremità sono complementari.

 

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Utilizzabilità degli enzimi di limitazione nella biologia molecolare

Il fatto che il DNA potrebbe essere maneggiato e le parti differenti del DNA potrebbero ora non essere impiombati insieme mai, nuovi campi di ricerca aperti prima dell'immaginato di. Molti dei metodi nella biologia molecolare oggi contano sugli enzimi di limitazione. "la limitazione" è derivata dal fatto che questi enzimi initally sono stati scoperti nel E. coli che è sembrato limitare l'infezione dei batteriofagi specifici ("virus" dei batteri). Si crede che enzimi di limitazione sia un meccanismo di difesa ospite evoluto dai batteri ed altri organismi per resistere alle infezioni virali e per aiutare con l'eliminazione delle sequenze virali.

In 1978, il premio Nobel per la medicina ha ricevuto a Werner Arber, a Daniel Nathans e ad Hamilton Smith per la loro scoperta dei endonucleases di limitazione, che conducono allo sviluppo delle tecnologie di DNA recombinant. Il primo uso pratico degli enzimi di limitazione nella scienza e nella medicina era la manipolazione dei batteri del E. coli per esprimere l'insulina umana recombinant per i diabetici.

Maneggiando ed usando gli enzimi di limitazione

Un'unità di attività dell'enzima di limitazione è definita dalla quantità di enzima di restrition richiesta per tagliare 1 microgrammo del DNA del batteriofago lambda a completamento in un momento di 1 ora.

Le analisi sviluppate dal fornitore degli enzimi sono più probabile fatte usando il DNA altamente purificato (cioè plasmidi o DNA dei fagi di lambda) come substrato e l'analisi condiziona che fornisce i risultati migliori con la loro preparazione particolare. Gli stati del laboratorio non sono spesso come ideali e un eccesso leggero di enzima o di periodo più lungo di incubazione è usato per contribuire ad accertare la digestione completa.

Ci sono molte soluzioni tamponi 'universali 'degli enzimi che funzioneranno con una varietà di enzimi, ma non fanno fronte spesso alle richieste più efficienti di alcun un enzima. Poiché gli amplificatori universali non sono come efficienti, non suggeriamo il loro uso sistematico in laboratorio (particolarmente per DNAs genomic complesso; le raccolte di DNAs genomic complesso sono solitamente alle alte concentrazioni nel DNA che inibiranno l'enzima; anche, i preparati di relativamente grezzi il DNA possono contenere gli inibitori che richiede più tempi maggiori di incubazione di ard degli enzimi delle unità per digestione completa). È sempre meglio usare gli stati suggeriti di analisi del fornitore per digestione di restricition. Alcuni fornitori hanno clonato gli enzimi che hanno requisiti molto diversi da altre versioni dello stesso enzima, in modo da controllano prima di utilizzare. Le concentrazioni negli enzimi sono date sempre dal lato del tubo degli enzimi. Gli enzimi di limitazione usati in laboratorio sono memorizzati sempre a -20 gradi C (in una base del glicerolo) e dovrebbero essere mantenuti come vicino a -20 gradi C come possibili prolungare la durata dell'enzima. Nell'installare le raccolte, porti il tubo di reazione al congelatore degli enzimi in una benna di ghiaccio; rimuova il tubo degli enzimi dal congelatore e mantenga il tubo su ghiaccio mentre funzionano con l'enzima. Immediatamente restituisca il tubo al congelatore una volta rifinito. Usi pipetmen indicato per gli enzimi di limitazione soltanto e sempre usano una punta pipetman fresca quando eliminano l'enzima dal tubo di riserva.

Punte su uso degli enzimi di limitazione

• Tutto il fornitore di enzimi di limitazione fornisce agli amplificatori specifici gli enzimi e questi dovrebbero essere memorizzati nel congelatore di -20°C. Gli enzimi di limitazione dovrebbero anche essere memorizzati a -20°C.
• Non componga mai le raccolte di limitazione con l'enzima di limitazione che compone più di 1/10 di volume finale. Ciò è dovuto il fatto che le proteine enzimatiche di limitazione sono memorizzate in glicerolo. Alle concentrazioni superiore a 10%, il glicerolo inibisce non soltanto la digestione ma anche può causare l'attività della stella - conducendo a aberrant, tagli di non-specifico del DNA.
• Installi una raccolta di controllo quando usando gli enzimi di limitazione. Ciò li aiuta a sapere se l'enzima sta funzionando correttamente ed installate bene la reazione. Usi un DNA del plasmide che genera i modelli conosciuti di frammentazione.
• Nel preparare le doppie raccolte degli enzimi, determini il contenuto salino degli amplificatori. Conduca la digestione di limitazione usando l'enzima con i requisiti più bassi del sale IN PRIMO LUOGO, quindi usi il secondo enzima registrando l'amplificatore del tubo di reazione alla seconda concentrazione ottimale nel sale.
• I preparati di il DNA possono avere impurità che possono inibire l'attività di digestione degli enzimi di limitazione. Alcuni kit di isolamento del DNA persino usano le alte soluzioni tamponi dell'EDTA per eluire il DNA. Ciò è giusta per memoria del DNA, ma le alte concentrazioni dell'EDTA possono inibire la digestione di limitazione. PCR purificano il vostro DNA e si eluiscono con TE o innaffiano se la vostra attività dell'enzima è inibita ma i vostri sguardi del DNA bene. Potreste inoltre aggiungere Mg2+ alla reazione e vedere se quel aiuti anche.
• Se non potete ottenere la digestione completa di limitazione del vostro DNA dopo la aggiunta dell'enzima supplementare, installi una nuova raccolta ed aggiunga lo spermidine ad una concentrazione finale di 2 millimetri.

Digestione degli enzimi di limitazione di DNA

Analitico contro le digestioni preparatorie degli enzimi di limitazione

Le digestioni del DNA sono condotte solitamente 25 - 50 in UL (microliters), quando desiderate appena controllare o analizzare il vostro DNA. Questi sono chiamati digestioni analitiche degli enzimi di limitazione.

Uno può digerire 0.25 - 2 ug (microgrammi) per le preparazioni analitiche. Ciò è perché su un minigel dell'agarosi (30ml), si può prevedere approssimativamente il 05ug (50 NG, i nanograms) per la fascia. La visualizzazione di una fascia dipende dalla lunghezza del DNA e dalla quantità di presente del DNA. In generale, più lungo il DNA presente nella fascia, il più facile è sarà di vedere.

Digestioni del DNA di molti microgrammi e più alti volumi da 50 - 500 l'UL (microliters) o più è preparatori, significando che state preparando i frammenti del DNA per purificazione successiva e state clonando.

Digestione di limitazione del protocollo del DNA

Ricetta per digestione degli enzimi di limitazione:

Analitico

Potreste aggiungere Mg2+ alla reazione di digestione (sotto forma di MgCl) se usate un grande volume di DNA. Dovreste fare questo particolarmente se l'amplificatore eluiste il vostro DNA in EDTA contenuto. Ciò è perché se "la X" è grande, lo IE > 20ul il volume, voi può avere bisogno di di aggiungere le legature dell'EDTA del magnesio a 4 moli di magnesio per ogni mole di l'EDTA. Quindi, il DNA in una soluzione (milimolar) da 1 millimetro dell'EDTA legherà 4mM di magnesio. Una buona regola pratica deve aggiungere 1 1ul di 10mM MgCl ad ogni 20ul di DNA.

Preparatorio

Incubi a 37°C per 1 - 3 ore.

1 unità è abbastanza enzima al DNA di ug digest1 almeno in 1 ora. Digerendo per 3 ore potreste digerire le quantità elevate di DNA. Poichè state aggiungendo 10-20 unità dell'enzima, potreste persino digerire 10ug di DNA in 1 ora! Gli enzimi sono costosi non le sprecano inutilmente!

Note su uso degli enzimi:

• Mantenga gli enzimi freddi.
• Mantenga sempre gli enzimi di limitazione su ghiaccio !
• Minimizzi il tempo che avete enzimi di limitazione su ghiaccio. Potete fare facilmente questo comprando una casella fredda (che è basicamente un blocco di metallo che mantenete i vostri enzimi dentro)

Riferimenti:

Sambrook, J., Fritsch, clonazione molecolare del T. e di E.F. Maniatis.(1989), un manuale di laboratorio. Seconda edizione. Pressa Fredda Del Laboratorio Del Porto Della Molla. pp 5.3- 5.32.

Se questo protocollo fosse utile, colleghisi prego a noi!

©Stazione Molecolare 2006