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Selezione del metodo di purificazione del DNA di Genomic

L'obiettivo di isolamento genomic del DNA dipende da che cosa le applicazioni del DNA dopo isolamento. La purezza, la sorgente, la quantità e la qualità di DNA sono tutte le edizioni che devono essere indirizzate prima dell'estrazione genomic del DNA. Una miriade intera di metodi differenti, le tecnologie ed i kit ora sono a disposizione ai ricercatori per isolare il DNA genomic dalle cellule.

• Quantità di DNA stata necessaria
• Peso molecolare e formato di DNA
• Purezza di DNA richiesta
• Applicazioni downstream di DNA
• Tempo a disposizione
• Facilità della tecnica o del metodo dell'estrazione del DNA
• Spesa o soldi disponibili

I metodi specifici del laboratorio o nazionali del DNA dell'estrazione per i laboratori che li hanno sviluppati ed usano spesso abbastanza bene regolarmente questi protocolli.

Noti tuttavia la normalizzazione di mancanza di questi metodi. Inoltre il rendimento del DNA e la qualità del DNA non sono sempre riproducibili da una persona al seguente.

Priorità bassa su isolamento e su purificazione del DNA di Genomic

Generalmente, tutti i metodi coinvolgono la rottura ed il lysis delle cellule. Ciò è seguita a volte dalla rimozione di RNA (con RNAses, sale o altri metodi). Scegliendo quale metodo usare dipenderà da molti fattori di selezione compreso:

Il DNA è isolato dalle proteine con parecchi metodi compreso digestione delle proteine dalla proteinasi K. Proteins degli enzimi è rimosso successivamente la salatura, l'estrazione organica, o legandosi del DNA ad un supporto in fase solida (quale una tecnologia della colonna o del silicone di scambio anionico).

Il DNA infine è recuperato dalla precipitazione dell'etanolo o dalla precipitazione dell'isopropanolo.

In generale, la separazione di DNA dalle cellule ed i componenti cellulari possono essere divisi in quattro fasi:

1. Rottura delle cellule
2. Lysis della cellula
3. Rimozione delle proteine e degli agenti inquinanti
4. Recupero di DNA

In alcuni protocolli genomic di isolamento del DNA, le fasi 1 e 2 sono unite.

I materiali hanno avuto bisogno di per il metodo dell'estrazione del DNA di Genomic

Amplificatore di lysis per la ricetta del DNA di Genomic:

50 millimetri Tris-HCl, pH 8.0
EDTA di 50mM
1% SDS
NaCl di 10mM

Metodo di purificazione del DNA di Genomic dai campioni del tessuto

1. Selezioni il campione del tessuto per usare. Assicurisi che il campione correttamente è preparato e mantenuto su ghiaccio. Se il campione non sarà usato immediatamente per l'estrazione del DNA, allora i campioni devono essere memorizzati correttamente nel congelatore di -20°C per a termine più lungo o in 4°C in breve uso di termine (poche ore).
2. Tagli il tessuto in più piccole parti. Per fegato o l'altro tessuto molle, non si preoccupi per fare le parti fini.
3. Aggiunga il tessuto (ad un mortaio preraffreddato del ghiaccio asciutto), immediatamente aggiunga il N2 dell'azoto liquido.
4. Cominci a macinare il tessuto in polvere fine. Aggiunga più Liq. N2 come stato necessario. Trasferisca la polvere fredda ad un tubo da 30 ml, permesso scoperchiato in modo da il N2 può volatilizzarsi.
5. Aggiunga 9 ml di amplificatore per-scaldato di lysis (5°C) e delicatamente risospenda la polvere.
6. Aggiunga l'UL 100 di 10mg/ml di proteinasi K, (cioè, 100 ug in soluzione). Incubi 55°C 1-18 ore. Mescoli delicatamente periodicamente. Aggiunga l'UL 100 di proteinasi K dopo le prime 2 ore, optimum: 3 ore che aggiungono proteinasi K a 1.5 ora.
7. Campione dell'ossequio molto delicatamente. Aggiunga 1 ml di 3M Na0Ac (pH 4.0), 10 ml di fenolo caldo (55°C), mescoli delicatamente ma throughly per 5-10 minuti.
8. Centrifughi i campioni per 15 minuti.
9. Ripeti l'estrazione calda del fenolo.
10. Estratto con il fenolo uguale del volume (10ml): Cia (una parte CIA della 1 parte phenol:1: Cia = 23 parti di chloroform:1 di alcool isoamilico della parte)
11. Estratto con l'estrazione uguale di CIA del volume (10ml)
12. La fase superiore dovrebbe essere relativamente chiara, se contiene i grandi colpi bianchi, o è molto lattea, (i) incuba ancora a 68°C 15 min. ed all'estratto del re-fenolo, (ii) inizio, ma incuba più lungamente con P-K.
13. Fase superiore di trasferimento al nuovo tubo. Aggiunga 2 volumi di etanolo freddo e mescoli delicatamente (sale: Na0Ac è già in soluzione). Usando un gancio e un pasteur sigillato pipetti la bobina verso l'esterno DNA. Pulisca fuori l'etanolo eccedente dal lato dei tubi. Risospenda in 2-5 mls di TE. Assicurisi che il DNA completamente è dissolto (permesso sull'agitatore delicato.)
14. Aggiunga la miscela della RNAsi (100 ug di RNAsi A, 10U di RNaseT1). Incubi 30 37°C minimi. ** potreste aggiungere la RNAsi prima della proteinasi K, incubate a 37°C per 1 ora ed allora iniziate la digestione della proteinasi. Potreste allora saltare punto 15 -.
15. Aggiunga 100 ug di proteinasi K, i incubae 37°C 30 minuti.
16. Aggiunga una volta 1/10 di volume 3M Na0Ac, estratto del fenolo, estratto di Phenol:CIA due volte, estratto di CIA una volta.
17. Aggiunga 2.5 volumi EtOH, metta in -20°C 30 minuti. Centrifughi 20 minuti.
18. Lavisi bene con 70%, rimuova tutto il EtOH. Se vi asciugate, non l'eccedenza ASCIUTTA.
19. Risospenda con attenzione, lentamente in1-2mls TE (soluzione tampone dell'Tris-EDTA). (1x o 0.1x).

Altri protocolli e metodi del DNA

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