Interazioni Analizzanti Della Proteina del DNA

Impari circa come analizzare le interazioni della DNA-PROTEINA.

Interazioni Analizzanti Di DNAProtein

Ci sono quattro tecniche importanti per analizzare le interazioni della DNA-PROTEINA. Le prime due tecniche (grippaggio del filtro e spostamento di mobilità del gel) determinano se il vostro DNA sta interagendosi con proteina. Le altre due tecniche (dnasi Footprinting e DMS Footprinting) indicano dove il luogo dell'obiettivo di interazione fra proteina e DNA si trova sul DNA.

Grippaggio Del Filtro

I filtri della membrana della nitrocellulosa sono utilizzati comunemente per sterilizzare per filtrazione le soluzioni. I filtri della nitrocellulosa possono legare il DNA, ma soltanto in determinate circostanze. Il DNA di Singlestranded si lega prontamente a nitrocellulosa, ma il DNA incagliato doppio da sè non. D'altra parte la proteina si lega e se una proteina è limitata a DNA double-stranded il complesso proteina-DNA si legherà. Riferiscasi prego all'articolo obbligatorio di analisi del filtro della nitrocellulosa per le più informazioni.

Gelifichi Lo Spostamento Di Mobilità

Per misurare le interazioni della DNA-PROTEINA questa tecnica conta sul fatto semplice che un piccolo DNA ha una mobilità molto più alta nell'elettroforesi del gel che lo stesso DNA quando deve limitare ad una proteina. Quindi possiamo identificare un frammento del DNA incagliato doppio di ordinamento, quindi lo mescoliamo con una proteina ed electrophorese il complesso. Allora sottoponiamo il gel nell'autoradiografia per rilevare la specie identificata. Il piccolo formato del DNA è importante in questa analisi. Se un gene intero fosse usato la relativa mobilità già sarebbe molto bassa e lo spostamento di mobilità causato tramite il grippaggio della proteina sarebbe difficile da rilevare. Di conseguenza dobbiamo sapere approssimativamente dove la proteina si lega al DNA in modo da possiamo preparare un frammento corto di limitazione, o persino un oligonucleotide double-stranded sintetico che conterrà il luogo dell'obiettivo per la proteina, ma poco altrimenti.

Dnasi Footprinting

Una volta che sappiamo che una proteina si lega ad un dato DNA possiamo usare footprinting per scoprire dove il luogo dell'obiettivo si trova sul DNA. La dnasi che footprinting conta sul fatto che una proteina, legandosi al DNA, copre il luogo obbligatorio ed in modo da lo protegge dall'attacco da Dnase. In questo senso lascia "un'orma" sul DNA. Il primo punto in un esperimento footprinting è estremità-identifica il DNA. Possiamo identificare il uno o il altro filo, ma soltanto uno per l'esperimento. Dopo, leghiamo la proteina al DNA. Allora trattiamo il complesso della DNA-PROTEINA con la dnasi I nelle condizioni miti (dnasi pochissima), di modo che una media di soltanto una tagliata si presenta per la molecola del DNA. Dopo, rimuoviamo la proteina dal DNA, separiamo i fili del DNA ed electrophorese i frammenti risultanti su un polyacylamide di alta risoluzione si gelificano accanto agli indicatori di formato. I frammenti risulteranno dall'altra estremità del DNA pure, ma non li rileveremo perché sono adenoidi. Includiamo sempre un controllo con DNA solo (nessuna proteina) e solitamente usiamo più di una concentrazione nella proteina in modo da possiamo vedere dalla scomparsa graduale delle fasce nella regione di orma che la protezione del DNA dipende dalla concentrazione della proteina aggiunta. L'orma rappresenta la regione di DNA protetta dalla proteina e quindi ci dice dove la proteina si lega.

DMS Footprinting

La dnasi che footprinting dà una buona idea della posizione del luogo obbligatorio per la proteina, ma la dnasi è una macromolecola ed è quindi uno strumento piuttosto smussato per il sondaggio dei particolari fini del luogo obbligatorio. Quale significa, quella là può essere lacune nell'interazione fra proteina ed il DNA in che la dnasi non si non adattare e quindi non rileverebbe. Inoltre, le proteine obbligatorie del DNA perturbano frequentemente il DNA all'interno della regione obbligatoria, storcente la doppia elica. Queste perturbazioni sono interessanti, ma generalmente non sono rilevate da Dnase che footprinting perché la proteina mantiene la dnasi assente. Per fare footprinting più dettagliato, abbiamo bisogno di più piccola molecola che può inserire nei nooks e nei crannies della DNA-PROTEINA complessa e riveliamo più dei subtleties dell'interazione. Uno strumento favorito per questo lavoro è il dimethylsulfate di metilazione dell'agente (DMS).

Con il DMS che footprinting cominciamo come in dnasi che footprinting, estremità-identificando il DNA ed il grippaggio la proteina. Allora metiliamo il complesso della DNA-PROTEINA con il DMS, applicando una terapia delicata in modo che in media soltanto una metilazione persino si presenti per la molecola del DNA. Dopo, sloggiamo la proteina e trattiamo il DNA con un reagente che elimina le purine metilate, creante i luoghi apurinic (deoxyriboses senza basi) sul DNA. Allora rompiamo il DNA a questi luoghi apurinic. Queste reazioni sono le stesse del DNA di Maxam-Gilbert che ordina le reazioni in serie. Infine electrophorese i frammenti ed autoradiograph del DNA il gel per rilevare il DNA identificato leghiamo. Ogni fascia si conclude vicino ad un nucleotide che è stato metilato e così non protetto dalla proteina.

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