Bioinformatics, Protocolli, Proteina Proteomics del RNA del DNA
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La precipitazione del DNA usando il sale e l'etanolo è un protocollo comunemente usato nel laboratorio per la concentrazione degli acidi nucleici quali DNA e RNA. Il metodo di base è sale e l'etanolo è aggiunto alla soluzione acquosa, che forza l'acido nucleico precipitare dalla soluzione. Ccentrifugation degli acidi nucleici precipitati e di lavaggio isola l'acido nucleico dal resto della soluzione. L'acido nucleico che contiene la pallina allora è lavato con l'etanolo di freddo 70% per rimuovere il sale.
Allora un secondo punto di centrifugazione è usato per isolare l'acido nucleico via dall'etanolo permettendo che l'etanolo sia eliminato. La pallina dell'acido nucleico allora è permessa asciugarsi ed allora è risospesa in amplificatore acquoso fresco o acqua di T (Tris).
Un mosto in primo luogo capisce perchè gli acidi nucleici sono solubili in acqua.
L'acqua (H2O) è una molecola polare che ha una carica negativa parziale vicino al dovuto dell'atomo di ossigeno unshared gli accoppiamenti degli elettroni e le cariche positive parziali vicino agli atomi dell'idrogeno.
dovuto questa natura polare di acqua, di altre molecole polari quale DNA o di RNA può interagirsi elettrostaticamente con le molecole di acqua, permettendoli di dissolversi facilmente in acqua.
La precipitazione rompe questa interazione e che crea i nuovi, permettendo che il DNA o il RNA esca dalla soluzione e sia isolato facilmente.
Il ruolo del sale nel protocollo è di neutralizzare le spese sulla base del fosfato dello zucchero dell'acido nucleico se DNA o RNA. I sali comunemente usati nella precipitazione del RNA e del DNA includono l'acetato del sodio.
Nella soluzione aqeous, l'acetato del sodio si rompe in su in Na+ e [ CH3COO ] -. gli ioni positivamente caricati del sodio neutralizza la base negativamente caricata sul DNA, specificamente i gruppi di PO3- sugli acidi nucleici, rendenti alla molecola dell'acido nucleico idrofilo e quindi molto meno solubile molto in acqua.
Le attrazioni elettrostatiche fra gli ioni di Na+ in soluzione e gli ioni di PO3- sono dettate da legge’del Coulomb s, che è influenzata dal costante dielettrico della soluzione. L'acqua ha un alto costante dielettrico, che lo rende ragionevolmente difficile affinchè il Na+ ed il PO3- venga insieme. L'etanolo d'altra parte ha un costante dielettrico molto più basso, rendente la molto più facile affinchè Na+ si interagisca con il PO3 -, proteggerlo’carica di s e preparare l'acido nucleico meno idrofilo, causandolo alla goccia dalla soluzione.
L'incubazione della miscela nucleica di acid/salt/ethanol alle temperature insufficienti (per esempio -20 o -80C) si cita comunemente nei protocolli come necessaria nei protocolli. Gli acidi nucleici tuttavia ad incubazione bassi di concentrazioni come 20ng/mL precipiterà a 0-4C in modo da per 15-30 minuti su ghiaccio è sufficienti.
L'obiettivo di questo protocollo è di precipitare il DNA, poichè il nome dice. Ciò solitamente è accoppiata con l'estrazione di cloroformio del fenolo ed è usata come modo di purificazione degli acidi nucleici. Ciò può anche essere usata come metodo per cambiare che soluzione o attenui il vostro acido nucleico è.
Questo protocollo egualmente funziona per la precipitazione del RNA (cura dell'introito a noi materiali liberi della RNAsi in questo caso).
-20°C per un'ora serve benissimo i più grandi (1mL di coltura, del plasmide batterici) importi di DNA
La pallina del DNA non sarà sempre visibile secondo quanto DNA state precipitando. Così sempre cura dell'introito nel carico dei vostri campioni nella centrifuga per ricordarsi del senso che stanno affrontando. La pallina del DNA sarà da parte del tubo che affronta la parte esterna della centrifuga.
Questo protocollo precipiterà tutti gli acidi nucleici, DNA non giusto. Se non desiderate il RNA nel vostro campione, uno dei molti modi occuparsi di esso deve risospendere semplicemente in TE + RNAsi all'ultimo punto e lasciarlo alla temperatura ambiente per 15mins-1hr.
Se il sale precipita, può essere rimosso facilmente
lavandosi con 70% EtOH. Il DNA non si dissolverà alla
temperatura ambiente,
ma il sale. (questo può anche essere usato per
rimuovere CsCl. Trovo alcune lavate con 70% EtOH sono più
facile della dialisi quando devo rimuovere CsCl da una preparazione
del plasmide. NOTA: non si raffreddi quando rimuove CsCl,
che ha un coefficente a temperatura elevata della soluzione.)
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