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La dnasi che footprinting è un metodo molecolare di biologia che permette la rilevazione delle interazioni della DNA-PROTEINA sfruttando la proprietà che una proteina che si interagisce con il DNA proteggerà il DNA a quel luogo di interazione da digestione di limitazione o da fenditura enzimatica della dnaasi. Un frammento di limitazione del DNA che contiene il luogo obbligatorio specifico è identificato ad un'estremità, solitamente con 32P ed è usato per footprinting.

La proteina ed il DNA sono permessi ibridare insieme e legarsi.

Il DNA che footprinting utilizza la dnasi I degli enzimi o il aseacidoucleicI del nucle di eoxyribon di d per digerire o tagliare liberamente via (o identificato) il DNA radioattivo che lascia alla proteina il DNA rilegato protetto. I frammenti di limitazione del DNA sono trattati leggermente con la dnasi I, che fa le rotture del singolo-filo (scalfitture) nel DNA. Una piccola quantità di enzima è usata tali che ci è una media di più meno di 1 nick/strand. La reazione allora è interrotta, il DNA è denaturato e la miscela è fatta funzionare su un poliacrilammide denaturante che ordina il gel in serie. Questi frammenti hanno separato tramite l'elettroforesi del gel sono esposti per rilevare la zona protetta del DNA analizzando il modello di fenditura delle fasce sul gel.

Il modello di fenditura del DNA in assenza di una proteina obbligatoria del DNA, citata tipicamente come DNA libero, è confrontato al modello di fenditura di DNA in presenza di una proteina obbligatoria del DNA. Se la proteina lega il DNA, il luogo obbligatorio è protetto da fenditura enzimatica. Questa protezione provocherà una zona libera sul gel che si riferisce a come "l'orma".

Variando la concentrazione della proteina DNA-LEGANTESI, l'affinità obbligatoria della proteina può essere valutata secondo la concentrazione minima di proteina a cui un'orma è osservata.

Ricette Dell'Amplificatore Di Footprinting Della Dnasi

Ricetta Obbligatoria Dell'Amplificatore Di Footprinting Della Dnasi

2X senza KCl/per 10mls:

importo: [ finale ]
Tris-HCl pH7.6: UL 500 di 1M: 50 millimetri
MgCl2: 125ul di 1M: 12.5mM
EDTA: un'UL 2 di 0.5M: 1mM
Glicerolo: 2 mls: 20%
DTT: UL 10 di 1M: 1 millimetro

Amplificatore obbligatorio (amplificatore dello spostamento del gel)

5X senza KCL
[ finale ]: ingrediente
20%: gylerol
5mM: MgCl2
2.5mM: EDTA
2.5mM: DTT
250mM: NaCl
50mM: Tris-HCL, pH 7.5
0.25mg/ml: poli (Di-CC) poli (Di-CC)

Amplificatore Di Ca/Mg

Per 10mls
CaCl2: UL 50 di 1M: 5 millimetri
MgCl2: UL 100 di 1M: 10 millimetri

Soluzione Di Caricamento
0.1 M.: NaOH:formamid (1:2 v/v)
0.1%: cyanol del xilene
0.1%: azzurro del bromofenolo

Arresti L'Amplificatore
10mls
NaCl: un'UL 400 di 5M: 200 millimetri
EDTA: un'UL 600 di 0.5M: 30 millimetri
Sds: 1 ml 10%: 1%

TEBe (Tris-EDTA-Beta mercap.)
Tris-HCl, pH 7.6: un'UL 500 di 1 m.: 50 millimetri
EDTA: 2ul di 0.5 m.: 1 millimetro
Beta-mercaptoetanolo: UL 10: 15mM

un amplificatore di 10 x K
per 1 ml
Tris-HCl pH 7.5: un'UL 100 di 1 m.: 100 millimetri
MgCl2: un'UL 100 di 1 m.: 100mM
DTT: UL 50 di 1M: 50 millimetri
dH2O: UL 750

Protocollo Di Footprinting Della Dnasi

Il DNA usato contiene solitamente il luogo obbligatorio della vostra proteina di interesse. Il DNA è purificato, quindi è digerito con i frammenti di limitazione per essere di un formato del appopriate. Il frammento del DNA è identificato su un'estremità (luogo obbligatorio > 25 B.P. dall'estremità).

Un identificare del filo può essere accomplised vicino:

1. isolamento del frammento con il enzyme(s) di limitazione che contiene sporgenza 5', identificando con Klenow ed il nucleotide caldo adatto. Allora raccolta con un enzima che rimuove un'estremità.
2. l'isolamento del frammento digerito con un enzima di limitazione che crea l'estremità 5'e 3', identificante con Klenow identificherà soltanto la sporgenza 5'.
3. Come "in a" ma con qualsiasi enzima ed usando la chinasi di polynucleotide per identificare 3'estremità (chinasi) e la digestione fuori di una delle estremità con un secondo (terzo) enzima di limitazione.
   (RICORDO: se identificando con Klenow, alla conclusione di reazione aggiunga un eccesso di nucleotide freddo dello stesso nucleotide che è identificato (cioè se usate dCTP32, aggiunga dCTP all'estremità) per assicurarsi tutte le estremità è riempito ugualmente.

Per i frammenti di Klenow, 0.3ug portano l'UL fino a 100 in TE, l'uccisione Klenow di calore a °C 68 per 10 minuti.

IDENTIFICANDO con una sporgenza 5'

Campione RXN: 15 NG sono esigenza di ogni reazione. Se facendo sonda per la quantità GIUSTA di aumento di molte reazioni di DNA fino a 300 ngs.
15ng: Frammento del DNA
UL 2: amplificatore di 10x K
UL 5: 32P dCTP 3.33 uM 10 uCi/ul
UL 2: dA di 2mM @, dTTP della DG
1 UL: Klenow
20 volumi finali dell'UL, 37°C 30 minuti.
-- aggiunga 1 dNTP dell'UL 10mM, 5 minuti @ 37°C.

-- aggiunga 80 l'UL TE. 68°C 15 minuti, ha messo sopra il ghiaccio.
-- colonna di rotazione G-50 (rotazione circa a 2000g)
-- aggiunga 1/10 di volume 3M Na0Ac, 2.5 volumi EtOH, ghiacciano 30 minuti, (facoltativi se [ DNA ] è = o > 3 ng/ul potreste inviare direttamente G-50) Microfuge 30 minuti.
-- lavata con 70%
-- asciutto porti in su in 5ul

Reazione Obbligatoria Per La Dnasi Footprinting

La reazione obbligatoria dovrebbe avere fra il KCl di 150mM e di 10 (più sale riduce legarsi ma specificità di aumenti). La concentrazione tipica è 50mM.

Grippaggio del DNA Della Proteina:
UL 25 dell'amplificatore obbligatorio 2X senza KCl
5ul di 3 ng/ul unilabeled il DNA
UL X di KCl per essere uguale 10-150 millimetri di KCl
dH20 all'UL del uguale 50 meno volume per il grippaggio protien
1-3 unità di Footprinting della proteina obbligatoria del DNA (o 10 - 160 ug dell'estratto nucleare grezzo)

-- la miscela delicatamente, ghiaccia 10 minuti.

SINCRONIZZAZIONE DI CONSERVAZIONE IN MENTE,
-- aggiunga l'UL 50 della soluzione di RT Ca/Mg, 18°C per 1 minuto.
-- aggiunga l'UL che 3 RQ1 la dnasi diluita (0.05 u/ul diluiti in Tris) INCUBA 1 minuto.
-- arresti un'aggiunta di 90 con le soluzioni di ARRESTO 37°C,

-- voi se il fenolo: Estratto di CIA e di CIA e precipitato dell'etanolo.
-- risospenda in 4ul della soluzione di caricamento.
-- funzioni su Urea-DNA standard di 5% che ordina il gel in serie (consideri il gel del cuneo) con i vicoli di caricamento del appopriate quali la scaletta del DNA, il DNA non tagliato ed i comandi.

Analizzi il modello footprinting.

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