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Clonazione del DNA

Impari circa la clonazione del DNA.

Clonazione del DNA

Un DNA (corto per DNA complemantary o il DNA della copia) è una copia del DNA di un RNA, solitamente un mRNA. A volte desideriamo fare una libreria del DNA, un insieme di cloniamo reprensenting altretanto come possibile dei mRNAs in un dato tipo delle cellule in un dato momento. Tali librerie possono contenere i dieci delle migliaia di differente clona. Altre volte, desideriamo fare un aclone particolare del DNA che contiene una copia del DNA di appena un mRNA. Questa tecnica che usiamo dipende in parte su cui di questi obiettivi desideriamo realizzare.

Librerie del DNA

Se desideriamo costruire una libreria del DNA, possiamo usare una strategia semplice ma efficace che conta su una traduzione chiamata trattata della scalfittura. L'essenza della traduzione della scalfittura è la rimozione simultanea di DNA davanti ad una scalfittura (una rottura singolo-incagliata del DNA) ed alla sintesi di DNA dietro la scalfittura. Il risultato netto deve muoversi, o traduca la scalfittura 'senso nel 5'-3. L'enzima usiamo solitamente la traduzione della scalfittura è la polimerasi I del DNA di E.coli, che ha 'attività di exonuclease un 5'-3 che permette che l'enzima degradi il DNA davanti alla scalfittura mentre si muove avanti.

La parte centrale tutta la procedura della clonazione del DNA è la sintesi del DNA da una mascherina di mRNA usando il transcriptase d'inversione. Il transcriptase d'inversione è come qualunque altro enzima disintetizzazione è che non può iniziare la sintesi del DNA senza un iniettore. Per ottenere intorno a questo problema, approfittiamo della coda del poly(A) alle 3'-estremità della maggior parte dei mRNAs eukaryotic ed usiamo il oligo(dT) come l'iniettore. Il oligo(dT) è complementare a poly(A), in modo da si lega al poly(A) alle 3'-estremità del mRNA ed innesca la sintesi del DNA, usando il mRNA come mascherina.

Dopo che il mRNA sia copiato, rendente un DNA singolo-incagliato ("il primo filo"), parzialmente degradiamo il mRNA con ribonucleasi la H (RNAsi H). Questo enzima degrada il filo del RNA di un ibrido di RNA/DNA appena di che cosa abbiamo bisogno per cominciare a digerire il RNA dal nostro primo DNA del filo. I frammenti restanti del RNA servono come iniettori per fare "il secondo filo," usando il primo come la mascherina. Ciò è la fase di scalfittura-traduzione del processo ed ancora, la polimerasi I del DNA del E. coli è l'enzima che usiamo effettuare la reazione di scalfittura-traduzione. Il risultato netto è un DNA double-stranded con un piccolo frammento di RNA alle 5'-estremità del secondo filo.
La nostra operazione seguente è di legare il DNA ad un vettore. Ciò era facile con le nostre parti di DNA genomic fendute con gli enzimi di limitazione, ma DNAS non hanno estremità appiccicose. Possiamo legare insieme le estremità smussate, anche se quello è un processo relativamente inefficiente. Tuttavia, se desideriamo il ligation efficiente accordato dalle estremità appiccicose, possiamo aderire le estremità appiccicose (oligo[dC ]) sul DNA, usando un enzima chiamato transferasi terminale di deoxynucleotidyl (TdT) o transferasi semplicemente terminale ed uno dei trifosfati di deoxribonucleoside. Nel caso, usiamo dCTP. L'enzima aggiunge dCMPs, uno alla volta, al 3'-ends del DNA. Nello stesso modo, fissiamo le estremità del oligo(dG) al nostro vettore e permettiamo il oligo (dC)s da temprare ai oligo(dG)s. Ciò riunisce il vettore ed il DNA in un DNA recombinant che può essere usato direttamente per trasformazione. L'accoppiamento basso fra le code del oligonucleotide è abbastanza forte che nessun ligation è richiesto prima di trasformazione. La ligasi del DNA all'interno delle cellule trasformate infine realizza il ligation.

Veda la molecola del DNA in 3-Dimensions