Clonazione del DNA

Soggetti Della Tribuna Della Clonazione del DNA

Filetti
Titolo/Manifesto Del Filetto	Ultimo Alberino	Risposte	Viste
Clonazione Antartica del DNA Della Fosfatasi dnamolecule	03-24-2008 02:03 PM da JO18 "	1	353
Colonie Bianche Blu Del Positive Di Selezione Della Clonazione liono	02-20-2008 08:45 da Priyanka "	1	588
DNA Smussato Della Clonazione Dell'Estremità pipette_man	01-23-2008 04:17 da postdock "	2	450
DNA della clonazione biojoe	05-16-2007 06:30 PM da biojoe "	0	897
DNA della clonazione biojoe	12-31-1969 11:00 PM da "	0	82
Clonazione da PCR pipette_man	03-28-2008 10:58 dal serenacorallini "	3	505
Vettore della clonazione aftabac	07-19-2007 04:53 da aftabac "	0	534
Sto cercando un medico o chiunque che conoscono qualche cosa circa clonazione!!! Rocky89	06-04-2008 12:46 da Rocky89 "	5	92
Clonazione help!!molecular di bisogno bsengez	11-12-2007 07:44 PM da bsengez "	4	554
Nessun Colonie Che Clonano Le Cellule Competenti Di Vettore princezz	01-24-2008 03:27 PM da princezz "	2	254
PCR "clonazione" questo sarebbe possibile? Ammie	09-17-2007 04:16 PM da danfive "	1	302
Clonazione di Topo e di PCR kiki06	12-05-2006 09:49 PM da kiki06 "	2	1283
problema con la raccolta di cloning/restriction shurgood	01-24-2008 10:15 PM da shurgood "	0	368

Ora invii una domanda nella tribuna della clonazione del DNA! Ottenga l'aiuto scattandosi qui

Inserti di clonazione nei plasmidi

Protocollo Della Clonazione del DNA

Per clonarlo abbia bisogno di quanto segue:

Vector il DNA o la vostra costruzione del plasmide

Il DNA di vettore può essere:
DNA del plasmide o di vettore (che deve essere

Per clonarlo abbia bisogno almeno di parecchi microgrammi (3-5 o più) del vostro DNA di vettore.

Inserisca il DNA (DNA che desiderate inserire nel plasmide o nel vettore)

Il DNA dell'inserto può essere:
Inserto del oligonucleotide (oligos con i metà-luoghi del taglio di limitazione temprati e fosforilati con PNK)
Inserto Generato Enzima Di Limitazione
Inserto di PCR (PCR con i luoghi del taglio degli enzimi di limitazione (il luogo intero è necessario!) nell'estremità’ 5 dell'iniettore)

Se l'inserto che desiderate clonare è meno di 60 il B.P., potete ordinare i oligonucleotides e temprarli insieme.

Se il vostro formato del DNA dell'inserto è piccolo (più meno B.P. di 1000), non avete bisogno teoricamente di tan DNA quanto il vostro vettore. Se il vostro formato del DNA dell'inserto è molto piccolo (10-200 B.P.), avete bisogno teoricamente di pochissimo di questo DNA.

In generale dovreste avere almeno 1 microgrammo di iniziare il DNA dell'inserto.

Preparando il DNA di vettore per la clonazione: Mini-preparazione, Midi-preparazione, Maxi-preparazione

Abbiamo trovato che il modo più facile preparare il DNA sta usando mini-preparazione un kit (Qiagen). Usiamo parecchie colonne per la stessa costruzione del DNA di vettore.

Per ogni colonna aggiungiamo circa 4 ml di batteri sviluppati libbra (aggiungiamo 2 ml di brodo dei batteri della libbra ad un tubo del eppendorf da 2 ml e filiamo due volte = 2 x 2 ml = 4 ml)

Punta: Sviluppi sempre circa 5 ml di libbra in tubi del falco da 15 ml, mantengono il 1 ml come i batteri del glicerolo immagazzinano frozen – nel congelatore di 80 C.

Come rendere ad un glicerolo le azione batteriche per – il congelatore di 80 C che manterrà per gli anni (voi non dovrà mai striare le piastre o fare ancora le cellule competenti! – li salva tempo)

Aggiunga semplicemente il glicerolo di 50% al vostro sviluppo batterico libbra. Ciò non deve essere IE esatto se siete lasciati con circa 1 ml di libbra batterica aggiungete circa 500 uL di glicerolo 100% e congelate – nei 80 C.

Dopo l'eluizione dell'ogni colonna con circa 50 uL dell'eb (l'amplificatore di eluizione, Qiagen, amplificatore di Tris – non contiene l'EDTA), riuniamo gli eluiti tali che abbiamo intorno 200 uL - 400 uL (o 4 – 8 colonne per la costruzione o il vettore). Ciò è dà abbastanza DNA cominciante di vettore per clonazione.

Nota: abbiamo trovato che l'EDTA in TE inibisce la digestione successiva di limitazione del DNA eluito da mini-preparazione e da altri kit di purificazione del plasmide.

Preparando il DNA dell'inserto per la clonazione

Inserisca il DNA deve essere

Digestione e taglio degli enzimi di limitazione il vostro vettore del plasmide per la clonazione del DNA

Il vettore del plasmide è tagliato solitamente.

Ligation dell'inserto e del vettore

Per legare l'inserto per vector, usi 200 NG del vettore come guida (la gente usa così piccolo quanto 50 il manuale – di NG N.E.B).

Inserisca NG = NG di vettore
Inserisca il formato di vettore di formato

Di conseguenza per legare un inserto di 500 B.P. in un vettore che di 5000 B.P. avreste bisogno di

Inserisca NG = 200 NG X 500
5000

Inserisca NG = 20 NG dell'inserto state necessarie per un 1: 1 ligation

Per un inserto 3: 1 ligation che di vettore avreste bisogno di: 60 NG

Ligation

Vettore del DNA    di uL X 200 NG
Inserto di uL     di Y (NG calcolata)
2 amplificatore di uL 10 X
1 ligasi NEB del DNA di uL T4
a 20 uL     H20

un totale di 20   uL

Prenda 5 uL del ligation ed aggiunga a 100 uL delle cellule Invitrogen dell'alfa del DH 5
(approvazione di risparmio di temi di Subcloning, una sparata più meglio il più bene, risparmio di temi per – i ligations duri ma costoso massimi).

Riscaldi La Scossa
Aggiunga 250 uL del SOC alle cellule competenti

Placchi l'INTERA quantità sulla piastra.

Sviluppi il overnite a 37 C

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Specifichi: Formato di vettore: B.P.
Specifichi: Formato dell'inserto: B.P.
Rapporto: (moli di il DNA dell'inserto per mole il DNA di vettore)

Per la NG del DNA di vettore, aggiunge NG del DNA dell'inserto.

Bioinformatics, Protocolli, Proteina Proteomics del RNA del DNA

Stazioni Intracellulari