Bioinformatics, Protocolli, Proteina Proteomics del RNA del DNA
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Questo luogo di Transfection è il vostro portal per tutte le cose relative al transfection delle cellule con il plasmide o il vettore del DNA, del RNA se siRNA o RNAi, o persino della proteina recombinant. Vi forniamo tutte le informazioni di base, protocolli per il transfection delle cellule, punti di analisi e di ottimizzazione e le informazioni d'analisi guasti di transfection delle cellule per diventare l'ultimo esperto!
Transfection descrive l'introduzione di materiale straniero nelle cellule eukaryotic usando un vettore del virus o altri mezzi di trasferimento.
Il transfection di termine per i metodi non-virali è usato il più spesso nel riferimento alle cellule di mammiferi, mentre la trasformazione di termine è preferita per descrivere il trasferimento non-virale del DNA in batteri e cellule eukaryotic dell'non-animale quali i funghi, le alghe e le piante.
Transfection delle cellule animali coinvolge tipicamente aprire i pori o 'i fori transitori nella membrana del plasma delle cellule, per permettere l'assorbimento di materiale. Il materiale genetico (come supercoiled le costruzioni del DNA o di siRNA del plasmide), o persino le proteine quali gli anticorpi, può essere transfected. Oltre che il electroporation, il transfection può essere effettuato mescolando un lipido cationico con il materiale per produrre i liposomi, che fondono con la membrana del plasma delle cellule e depositano il loro carico all'interno.
Il significato originale del transfection era 'infezione da trasformazione ', cioè introduzione di DNA (o di RNA) da un virus o da un batteriofago dell'eucariota nelle cellule, con conseguente infezione. Poiché la trasformazione di termine ha avuta altro senso nella biologia animale delle cellule (un cambiamento genetico permettendo propagazione di lunga durata nella coltura, o nell'aquisizione delle proprietà tipiche delle cellule di cancro), il transfection di termine ha acquistato, per le cellule animali, il relativo significato attuale di un cambiamento nelle proprietà delle cellule causate dall'introduzione di DNA.
Transfection è un metodo da cui il DNA sperimentale può essere messo in una cellula di mammiferi coltivata. Tali esperimenti solitamente sono effettuati usando il DNA clonato che contiene le sequenze di codificazione e gestiscono le regioni (promotori, ecc) per esaminare se il DNA sarà espresso. Poiché il DNA clonato può essere modificato estesamente (per esempio, i luoghi obbligatori della proteina sul promotore possono essere alterati o rimossi), il transfection è usato spesso per esaminare se una modifica particolare interessa la funzione di un gene.
Schema Di Transfection:
L'abilità sintetizza il RNA in laboratorio è critica a molte tecniche. Le sonde radioattive e non-radioattive del RNA sono richieste per molti protocolli e possono essere sintetizzate facilmente nelle reazioni in vitro della trascrizione della piccola scala permettendo il loro uso nelle ibridazioni della macchia e nelle analisi di protezione della nucleasi.
La trascrizione in vitro richiede una mascherina lineare purificata del DNA che contiene un promotore, i trifosfati del ribonucleotide, un sistema dell'amplificatore che include DTT ed il magnesio
La trascrizione in vitro richiede una mascherina lineare purificata del DNA che contiene un promotore, i trifosfati del ribonucleotide, un sistema dell'amplificatore che include DTT ed il magnesio
Ci sono vari metodi di introduzione del DNA straniero in una cellula eukaryotic. Molti materiali sono stati usati come elementi portanti per il transfection, che può essere diviso in tre generi: polimeri, liposomi e nanoparticles (cationici).
Uno (e meno certi) dei metodi più poco costosi sono transfection dal fosfato di calcio, originalmente scoperto da F. L. Graham e da A. J. van der Eb in 1973[citation stato necessario ] (veda inoltre [ 1 ]). la soluzione salina HEPES-attenuata (HeBS) che contiene gli ioni del fosfato è unita con una soluzione del cloruro di calcio che contiene il DNA per essere transfected. Quando i due sono uniti, un precipitato fine del calcio positivamente caricato e del fosfato negativamente caricato formerà, legando il DNA per essere transfected sulla relativa superficie. La sospensione del precipitato allora è aggiunta alle cellule per essere transfected (solitamente una coltura delle cellule sviluppata in uno strato monomolecolare). Tramite un processo non interamente capito, le cellule prendono alcuno del precipitato e con esso, il DNA.
Altri metodi usano i residui organici altamente ramificati, cosiddetti dendrimers, per legare il DNA e per entrarli nella cellula. Un metodo molto efficiente è l'inclusione del DNA da essere transfected in liposomi, cioè piccoli, enti membrana-limitati che sono per alcuni versi simili alla struttura di una cellula e possono realmente fondere con la membrana delle cellule, scaricanti il DNA nella cellula. Per le cellule eukaryotic, il lipido-catione basato transfection è usato più tipico, perché le cellule sono più sensibili.
Un altro metodo è l'uso dei polimeri cationici quali Deae-dextrano o il polyethylenimine. Il DNA negativamente caricato si lega al polycation ed il complesso è preso dalla cellula via il endocytosis.
Un metodo diretto al transfection è la pistola del gene, in cui il DNA è accoppiato ad un nanoparticle di un solido inerte (comunemente oro) che allora "è sparato" direttamente nel nucleo delle cellule dell'obiettivo. Il DNA può anche essere introdotto nelle cellule usando i virus come elemento portante. In tali casi, la tecnica è chiamata transduction virale e, le cellule sarebbero transduced.
Altri metodi del transfection includono il nucleofection, electroporation, scossa di calore, magnetofection e reagenti riservati di transfection quale Lipofectamine, Dojindo Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene o DreamFect.
Per la maggior parte delle applicazioni del transfection, è sufficiente se transfected il gene soltanto transitoriamente è espresso. Poiché il DNA introdotto nel processo di transfection non è inserito solitamente nel genome nucleare, il DNA straniero è perso nella fase successiva quando le cellule subiscono la mitosi. Se è che transfected gene voluto realmente rimane nel genome della cellula e le relative cellule della figlia, un transfection stabile devono accadere.
Compire questo, un altro gene è co-transfected-transfected, che dà alla cellula un certo vantaggio di selezione, quale resistenza verso una determinata tossina. Alcuno (molto pochi) del transfected le cellule, per caso, avrà inserito il materiale genetico straniero nel loro genome. Se la tossina, verso cui il gene co-transfected-transfected offre la resistenza, allora è aggiunta alla coltura delle cellule, solo quelle poche cellule con i geni stranieri inseriti nel loro genome potranno proliferare, mentre altre cellule moriranno. Dopo l'applicazione della questa pressione di selezione per un certo tempo, soltanto le cellule con un transfection stabile rimangono e possono coltivarsi più ulteriormente.
Un agente comune per il transfection stabile è Geneticin, anche conosciuto come G418, che è una tossina che può essere neutralizzata dal prodotto del gene resistente della neomicina.
La trascrizione in vitro richiede una mascherina lineare purificata del DNA che contiene un promotore, i trifosfati del ribonucleotide, un sistema dell'amplificatore che include DTT ed il magnesio
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