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Contaminazione Del Micoplasma & Coltura Delle Cellule

Includiamo qui per i laboratori della coltura delle cellule, le informazioni sulle contaminazioni del micoplasma e le ultime discussioni della tribuna del micoplasma per tutte le vostre domande e discussioni di contaminazione.

Priorità bassa Del Micoplasma

Mycoplasmas è un genere dei batteri che difettano di una parete delle cellule. dovuto una mancanza di parete delle cellule, sono resistenti a molti antibiotici compreso penicillina o ad altri antibiotici del beta-lattame che designano la sintesi come bersaglio della parete delle cellule.

Il micoplasma è parassita o saprofito. Parecchio il micoplasma malattia-sta causando in esseri umani, compreso i pneumoniae del M., che è una causa importante di polmonite atipica e di altri disordini respiratori ed il genitalium del M., che si crede partecipare alle malattie infiammatorie pelviche. Possono causare o contribuire ad alcuni cancri.

Genere Micoplasma

Il genere micoplasma è uno di parecchi generi all'interno del codice categoria Mollicutes. Mollicutes è batteri che hanno piccoli genomes, difettano di una parete delle cellule ed hanno un Gascromatografia-soddisfare basso (18-40 %).

Ci è oltre 100 specie riconosciute del genere micoplasma. Il loro formato del genome varia da 0.58 1.38 megabase-accoppiamento. Mollicutes è parassiti o commensals degli esseri umani, degli animali (insetti compresi) e delle piante; il genere micoplasma è tramite la definizione limitata ai calcolatori centrali vertebrati. Il colesterolo è richiesto per lo sviluppo della specie del genere micoplasma così come determinati altri generi dei mollicutes. La loro temperatura ottimale di sviluppo è spesso la temperatura del loro calcolatore centrale se warmbodied (per esempio centigrado 37 gradi in esseri umani) o temperatura ambientale se il calcolatore centrale non può regolare la relativa propria temperatura interna. L'analisi delle sequenze ribosomal del RNA 16S come pure il soddisfare del gene suggerisce fortemente che i mollicutes, compreso i mycoplasmas, sono collegati strettamente al lattobacillo o al ramo del clostridio dell'albero filogenetico (stricto di sensu di Firmicutes).

Righe e Mycoplasmas delle cellule

Nelle colture delle cellule, i mycoplasmas possono indurre i cambiamenti cellulari, compreso i aborations del cromosoma, i cambiamenti nel metabolismo e lo sviluppo delle cellule. Le infezioni severe del micoplasma possono distruggere una riga delle cellule o rendere le righe costose o preziose delle cellule inutili.

Contaminazione della coltura delle cellule con micoplasma

Mycoplasmas è trovato spesso nei laboratori di ricerca come agenti inquinanti nella coltura delle cellule. La contaminazione micoplasmica della coltura delle cellule si presenta dovuto contaminazione dagli individui o dagli ingredienti contaminati di terreno di coltura delle cellule.

Metodi Di Rilevazione Del Micoplasma

Le cellule del micoplasma sono solitamente più piccole di 1 µm e quindi abbastanza difficili da rilevare con i metodi convenzionali di microscopia. Le tecniche di rilevazione includono:

• PCR
• PCR In tempo reale
• Placcatura sull'agar sensibile
• Macchie del DNA compreso DAPI o o la macchia di Hoescht

Protocollo Di Rilevazione Di Contaminazione Del Micoplasma Della Macchia Di Hoechst

Un Hoechst (sigma, catalogo #:H6024) macchiante metodo per micoplasma:

1. Per le cellule aderenti, disponga un vetro sterile della copertura nella capsula di Petri. Aggiunga 2-3 gocce della sospensione delle cellule nel mezzo dei coverglass (secondo il tasso di accrescimento delle vostre cellule).
2. Allora aggiunga con attenzione 2-3 ml di media senza disturbare le cellule. Sviluppi le cellule fino a che non siano 50 -70% confluent.

Cellule Di Riparazione:

1. Prepari il fissativo delle cellule che è un metanolo di fo 3:1 della miscela: acido acetico glaciale (M:AA). Vi assicurate preparare questo fresco prima dell'uso.
2. Scarti il media dalle cellule crescenti. Aggiunga 2 ml del metanolo: soluzione glaciale dell'acido acetico M:AA a goccia a goccia sul lato della piastra (non direttamente sulle cellule). Turbina la piastra e scarta la soluzione.
3. Aggiunga 2 ml di M:AA, turbini e vada sopra per 2-3 minuti alla temperatura ambiente.
4. Scarto M.: Soluzione e risciacquatura di aa con acqua
5. Lasci a concentrazione di riserva asciutta della macchia di Hoecht dell'aria (potete mantenere la piastra fino a che non siate aspettare per macchiare) (gatto # 33258 dal sigma) = 0.1 mg/ml in acqua che potete filtrare sterilizzate in questa fase usando i 0.2uM il contenitore dell'involucro del filtrante in alluminio sventa il deposito ad una soluzione di funzionamento dei 4 oC prepara fresco ogni volta come necessario fa la diluzione di 1:1000 (0.1 µg/ml) dell'immagazzin in acqua

Macchiatura Delle Cellule:

1. Aggiunga abbastanza macchia di Hoechst per riguardare l'intero slittamento della copertura (uso 1-2ml per una piccola capsula di Petri).
2. Lasci la macchia sopra per 45 minuti - 1 ora (nell'oscurità).
3. Risciacqui bene con acqua.
4. Monti su uno scorrevole del microscopio (miscela mountant: 22 millimetri di acido citrico; 55.6 millimetri di fosfato disodico; glicerolo di 50%, miscela di pH 5.5) al posto una goccia o due sullo slittamento della copertura (cellule in su) e sullo slittamento della copertura del posto (cellule giù) sullo scorrevole.
5. Visualizzi sotto il microscopio di fluorescenza

Nota: memorizzi la macchia di Hoechst a 4oC almeno, o l'aliquota nel congelatore per immagazzinaggio a lungo termine.