Protocollo Di Isolamento Del Protoplasto

Preparazione dei protoplasti metabolicamente competenti

Saji Menon e Vibha Tyagi
Istituto di Birla di ricerca scientifica, cerchio della statua, Jaipur (Ragiastan), India

(Tabella è elencata qui sotto)

Fogli freschi dell'introito da 4-5 vecchie piante in modo asettico crescenti di settimana.
La superficie sterilizza in etanolo di 70% seguito trattando con 0.1% cloruri mercurici per 1 minuto.
Lavi completamente i fogli con acqua distillata sterile.
Sbucci l'epidermide più bassa del tessuto del foglio e dispongala nella soluzione del mannitolo di 0.5M per un'ora in un petriplate.
Rimuova la soluzione del mannitolo e sostituiscala con la soluzione sterilizzata per filtrazione degli enzimi.
Incubi le piastre nell'oscurità per 16-20 ore a 25oC.
Separi lo strato del protoplasto tramite filtrazione per mezzo della membrana del nylon di 0.45µM.
Centrifughi il filtrato a 1000g per 10 minuti a oC 4.
Rimuova il galleggiante e risospenda la pallina nel media di lavaggio del protoplasto delle cellule.
Centrifughi a 1000g per 10 minuti.
Ripeti due volte punto 9.
Infine sospenda la pallina del protoplasto ad una densità di 1*105 ml/l nel terreno di coltura modificato del protoplasto.
Placchi i protoplasti come benissimo strato sottile nei petriplates.
Incubi le piastre a oC 25 nell'oscurità.

S.No.	Costituenti	Importo
A	Sali Minerali
1	Nitrato di ammonio	82.5 gm/l
2	Nitrato Del Potassio	95.0 gm/l
3	Acido borico	1190 mg/l
4	Di-idrogenofosfato Del Potassio	34 mg/l
5	Ioduro Del Potassio	166 mg/l
6	Molibdato Del Sodio	250 mg/l
7	Biidrato Del Cloruro Del Cobalto	25.0 mg/l
8	Biidrato Del Cloruro Di Calcio	88.0 gm/l
9	Solfato Heptahydrate Del Magnesio	74.0 gm/l
10	Tetraidrato del solfato del manganese	4460 mg/l
11	Solfato Heptahydrate Dello Zinco	1720 mg/l
12	Pentaidrato Del Solfato Di rame	25.0 mg/l
13	Diammino tetra sale disodico dell'acido acetico dell'etilene	7.45 gm/l
14	Heptahydrate del solfato ferroso	5.57 gm/l
B	Zuccheri
1	Glucosio	30.0 gm/l
2	Ribosio	0.5 gm/l
3	Mannosio	0.5 gm/l
4	Sorbitolo	0.5 gm/l
C	Acidi Organici
1	Piruvato Del Sodio	5.0 mg/l
2	Acido citrico	10.0 mg/l
3	Acido malico	10.0 mg/l
D	Vitamine
1	Cloridrato Della Tiamina	100 mg/l
2	Nicotinammide	500 mg/l
3	Cloridrato Della Piridossina	500 mg/l
4	Pantotenato del calcio	250 mg/l
5	Biotina	100 mg/l
6	Acido ascorbico	75.0 mg/l
7	Riboflavina	50.0 mg/l
8	Inositolo	100 gm/l
E	Ormoni
1	2,4-Dichloro Fenossi Acido Acetico (2,4-D)	0.5 mg/l
2	Purina Amminica Benzilica (BAP)	1.0 mg/l