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Protocollo di isolamento del protoplasto



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Protocollo di isolamento del protoplasto

protoplasto

Preparazione dei protoplasti metabolicamente competenti

 

Saji Menon e Vibha Tyagi
Istituto di Birla di ricerca scientifica, cerchio della statua, Jaipur (Ragiastan), India

 

Materiali richiesti per isolamento del protoplasto

  • Etanolo di 70%
  • 0.1% Cloruro mercurico
  • mannitolo di 0.5M

 

  • Soluzione degli enzimi:
  • Cellulasi 0.25% Macerozyme R-10 di 1%
  • 27.2 mg/l KH2PO4
  • 101 mg/l KNO3
  • 1480 mg/l CaCl2.2H2O
  • 246 mg/l MgSO4.7H2O
  • mannitolo di 0.5M (pH 5.6)

 

  • Media di lavaggio del protoplasto delle cellule:
  • mannitolo di 0.5M (pH 5.6)
  • 27.2 mg/l KH2PO4
  • 101 mg/l KNO3
  • 1480 mg/l CaCl2.2H2O
  • 246 mg/l MgSO4.7H2O
  • Terreno di coltura modificato del protoplasto       

(Tabella è elencata sotto)

 

Protocollo per la preparazione dei protoplasti metabolicamente competenti

  • Prenda i fogli freschi da 4-5 vecchie piante in modo asettico crescenti di settimana.
  • La superficie sterilizza in etanolo di 70% seguito dal trattamento con 0.1% cloruri mercurici per 1 minuto.
  • Lavi completamente i fogli con acqua distillata sterile.
  • Sbucci l'epidermide più bassa del tessuto del foglio e dispongala nella soluzione del mannitolo di 0.5M per un'ora in un petriplate.
  • Rimuova la soluzione del mannitolo e sostituiscala con la soluzione sterilizzata per filtrazione degli enzimi.
  • Incubi i piatti nello scuro per 16-20 ore a 25oC.
  • Separi lo strato del protoplasto tramite filtrazione per mezzo della membrana del nylon di 0.45µM.
  • Centrifughi il filtrato a 1000g per 10 minuti a 4 Oc.
  • Rimuova il galleggiante e risospenda la pallina nel media di lavaggio del protoplasto delle cellule.
  • Centrifughi a 1000g per 10 minuti.
  • Ripeti due volte punto 9.
  • Infine sospenda la pallina del protoplasto ad una densità di 1*105 ml/l nel terreno di coltura modificato del protoplasto.
  • Placchi i protoplasti come benissimo strato sottile nei petriplates.
  • Incubi i piatti a 25 Oc nello scuro.

 

Terreno di coltura modificato del protoplasto

S.No.

Costituenti

Importo

A

Sali minerali

 

1

Nitrato di ammonio

82.5 gm/l

2

Nitrato di potassio

95.0 gm/l

3

Acido borico

1190 mg/l

4

Di-idrogenofosfato del potassio

34 mg/l

5

Ioduro di potassio

166 mg/l

6

Molibdato del sodio

250 mg/l

7

Biidrato del cloruro del cobalto

25.0 mg/l

8

Biidrato del cloruro di calcio

88.0 gm/l

9

Heptaidrato del solfato di magnesio

74.0 gm/l

10

Tetraidrato del solfato del manganese

4460 mg/l

11

Heptaidrato del solfato di zinco

1720 mg/l

12

Pentaidrato del solfato di rame

25.0 mg/l

13

Diammino tetra sale disodico dell'acido acetico dell'etilene

7.45 gm/l

14

Heptaidrato del solfato ferroso

5.57 gm/l

B

Zuccheri

 

1

Glucosio

30.0 gm/l

2

Ribosio

0.5 gm/l

3

Mannosio

0.5 gm/l

4

Sorbitolo

0.5 gm/l

C

Acidi organici

 

1

Piruvato del sodio

5.0 mg/l

2

Acido citrico

10.0 mg/l

3

Acido malico

10.0 mg/l

D

Vitamine

 

1

Cloridrato della tiamina

100 mg/l

2

Nicotinammide

500 mg/l

3

Cloridrato della piridossina

500 mg/l

4

Pantotenato del calcio

250 mg/l

5

Biotina

100 mg/l

6

Acido ascorbico

75.0 mg/l

7

Riboflavina

50.0 mg/l

8

Inositolo

100 gm/l

E

Ormoni

 

1

2,4-Dichloro fenossi acido acetico (2,4-D)

0.5 mg/l

2

Purina amminica benzilica (BAP)

1.0 mg/l