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Anticorpi Di Polyclonal

Interamente circa gli anticorpi di polyclonal.

Risorse Esterne Relative Dell'Anticorpo Di Polyclonal - Protocolli:

• Macchia Occidentale
• Immunoblot
• Immunoprecipitazione (IP)
• Creazione degli anticorpi usando i peptidi

Inoltre stazione dell'anticorpo di chiamata per più sugli anticorpi di Polyclonal. È un nuovo luogo che elenca i fornitori dell'anticorpo, impara circa gli anticorpi ed i protocolli.

Protocolli dell'anticorpo di Polyclonal:

• Mouse D'Immunizzazione
• Preparazione del siero da anima
• Immunizzazione Del Coniglio
• Procedura di spurgo del coniglio
• Ottenere siero
• Precipitazione del solfato dell'ammonio di IgG dal siero
• Immunizzazione
• Protocollo di ELISA per la selezione dell'anticorpo di Polyclonal

Anticorpo Di Polyclonal

 

Gli anticorpi di Polyclonal sono anticorpi derivati da molte B-cellule o righe della B-cellula, simili alla miscela degli anticorpi trovati in sieri di anima.

Gli anticorpi di Polyclonal sono quindi una miscela di molte specificità differenti dell'anticorpo.

I preparati di l'anticorpo di Polyclonal comprati sono miscele degli anticorpi di molte specificità differenti allo stesso antigene.

L'immunizzazione di un coniglio, del mouse, della capra, del pollo, o dell'altro animale produce gli anticorpi di polyclonal. I sieri animali possono essere usati direttamente, comunque è migliore purificare gli anticorpi di polyclonal per uso del laboratorio.

Preparato di L'Anticorpo Di Polyclonal

Sulla base del protocollo dal Dott. David Bowtell

Immunizzazione dei mouse:

Le iniezioni per immunizzare i mouse per la generazione degli anticorpi di polyclonal dovrebbero essere rese a intervalli almeno di due settimane diverse.

I seguenti 2 adiuvanti sono riusciti:

• Adiuvante di Freund ed adiuvante di MPL+TDM (RIBI ImmunoChem Research, Inc.). Il MPL è meno pericoloso che il primo adiuvante.

1. Per la prima iniezione di immunizzazione: inietti 15 - 50 ug se antigene in adiuvante dell'UL 200, iniettato per via sottocutanea.
2. La seconda iniezione dovrebbe accadere più successivamente 2 settimane; Dovete allora amplificare con 15 - 50 ug dell'antigene in adiuvante. (se il tempo consente, amplifichi ancora un mese più successivamente).
3. Sette - 10 giorni più successivamente sanguina il siero della prova e del mouse usando l'analisi che sarà usata per selezione. Se il titolo non è abbastanza su, spinta ancora due settimane dopo spinta precedente.

PARTE SUPERIORE

Preparazione Del Siero:

1. Dopo la raccolta, l'anima dovrebbe essere permessa coagularsi per 60 minuti. a 37°C o a O.N a 4°C.
2. Separi il grumo dai lati del tubo (squillare) che per mezzo di una pipetta di pasteur. Disponga il grumo a 4°C O.N.
3. Fili a 10000 la x g per 10 min. a 4°C per separare il siero.
4. Il siero può essere memorizzato a -20°C dopo la aggiunta del glicerolo a 50%.

Se monoclonal gli anticorpi sono voluti, una volta che fate "un buon" polyclonal e un metodo di vagliatura certo continuare al punto seguente.

PARTE SUPERIORE

Conigli:

I conigli sono immunizzati essenzialmente come descritto precedentemente. Iniezioni:

1. In primo luogo nell'iniezione completa 100-200ug/1ml del Freund, due luoghi (sopra ogni spalla).
2. In secondo luogo 1 mese più successivamente in Freund INCOMPLETO come sopra.
3. Salasso 2 settimane più successivamente. Spinta 2 settimane più successivamente ancora (un ciclo da 2 + 2 settimane).

PARTE SUPERIORE

 

PRODUZIONE DEGLI ANTICORPI DI POLYCLONAL IN CONIGLI (BIANCO DI NEUSEELAND)

Sulla base del protocollo da Dr.Walter Steffen.

I conigli dovrebbero essere di 3-4 chilogrammi in peso e circa 3 mesi. Circa un terzo del coniglio abbia gli anticorpi ed immunoactivity endogeni della anti-cheratina per i vari componenti cellulari. Ciò dà risalto all'importanza di presa del siero pre-immune da tutto il dato coniglio.

Amplificatori e soluzioni:

• Soluzione saturata del solfato dell'ammonio, un EDTA da 2 millimetri, pH 8.0
• 50 millimetri di acetato dell'ammonio, pH 8.0
• etanolo di 70%
• Adiuvante del Freund (completo & incompleto)
• Salino attenuato fosfato (PBS) (veda sotto)
• Vaselina
• Xilene

PARTE SUPERIORE

• Porti il coniglio dalla relativa gabbia e dispongalo saldamente in una casella trattenente che lascia l'orecchio accessibile. Mantenga relativamente la calma del coniglio. I volumi di anima fino a 50 ml possono essere raccolti facilmente dall'arteria principale che funziona giù il centro della superficie dorsale dell'orecchio.
• Rada l'orecchio di sinistra intorno alla vena di sinistra con una lamierina di rasoio fresca.
• Tamponi l'orecchio con l'etanolo o l'isopropanolo di 70%.
• Tamponi l'orecchio con il xilene intorno al ciclo della arteria-vena per dilate.
• Tenga la punta dell'orecchio (saldamente) e del tubo dell'accumulazione in una mano e con l'inserto libero della mano un ago ipodermico 19G nell'arteria dilated. L'anima dovrebbe cominciare a fluire immediatamente nel tubo dell'accumulazione. Per i risultati migliori usi una parte dell'arteria intermedia lungo l'orecchio.
• Raccolga fino a 50 ml di anima. Applichi la pressione appena anteriore a punto dell'entrata dell'ago a spurgo di arresto.
• Applichisi la vaselina all'orecchio per soothe l'irritazione del xilene.
• Metta la vaselina supplementare sul taglio.

Ottenere Siero:

PARTE SUPERIORE

• Tubo di eccitazione con anima raccolta per ricoprire superficie e per impedire il collegamento del grumo al tubo.
• Incubi a oC 37 per 1 ora.
• Centrifughi a 2.500 g (che regola #7 in un piano d'appoggio clinico) per 10 minuti.
• Rimuova il grumo e fili il siero a 3.000 g per 10 minuti.
• Il siero dovrebbe essere memorizzato congelato.

Precipitazione del solfato dell'ammonio di IgG dal siero (oC 4, effettuato nella cella frigorifera):

La precipitazione del solfato dell'ammonio è un metodo facile per ottenere una frazione ragionevolmente pura di IgG.

PARTE SUPERIORE

• Siero dello stagno da un coniglio
• Siero del peso
W1 = _____ g
• Tubi della lavata con il minuto. PBS e pesano ancora.
W2 = _____ g
• Aggiunga 2/3 di volume del solfato dell'ammonio saturato W2, un EDTA da 2 millimetri, il pH 8.0
Nota: aggiunga molto lentamente, a goccia a goccia mentre si mescolano al oC 4 o utilizzi la pompa peristaltica.
• Mescolisi per 15 minuti.
• Trasferimento nei tubi centrifughi da 40 ml; coppa della lavata con 3 parti di PBS: 2 parti di solfato dell'ammonio ed aggiunge ai tubi.
• Rotazione a 12.000 g (Beckman JA-20: 10.000 giri/min.) per 10 minuti.
• Scarti il galleggiante.
• Risospenda la pallina in PBS [ 1/2 W1 = volume di 1/2. ].
• Fili a 12.000 g per 10 minuti, scarti la pallina.
• Raccolga il galleggiante in coppa, pareti della lavata con PBS.
Determini W3 = _____
• Aggiunga 2/3 di volume. Solfato dell'ammonio saturato W3, mentre mescolandosi. Continui a mescolarsi per 15 minuti.
• Trasferisca la sospensione ai tubi centrifughi da 40 ml, tubo della lavata con la soluzione del solfato di PBS/ammonium.
• Fili a 12.000 g per 10 minuti.
• Scarti il galleggiante.
• Risospenda le palline in 1/4 di W1 PBS.
• Dializzi contro PBS, 3-times 6 ore ciascuno.
• Metta bene il siero in un tubo graduato, sacchetto di dialisi della risciacquatura con PBS.
• Porti fino a 1/2 W1 = volume di 1/2 in PBS.
• Determini la concentrazione e l'aliquota nella proteina per memoria. Misuri l'assorbimento a 280 nm. L'assorbimento di 1 soluzione di mg/ml IgG è circa 1.5.

Immunizzazione:

PARTE SUPERIORE

• Dissolva l'antigene di ~400-600 g (~200-300 g per l'iniezione) in 2.2 ml 50 millimetri di acetato dell'ammonio, amplificatore adatto di pH 8.0 o altro. La concentrazione dipende da antigenicità di proteina da iniettare.
• La quantità di antigene ha dovuto immunizzare un animale dipende da esso antigenicità ed il metodo di immunizzazione. Se le proteine con antigenicità bassa sono usate, sarà utile denaturare la proteina con una concentrazione bassa di SDS (fino a 0.2%). Soltanto l'antigene altamente purificato dovrebbe essere usato per la produzione degli anticorpi di polyclonal. Un metodo facile per ottenere un antigene puro è da SDS-PAGE. Le proteine possono essere trasferite ad un foglio di nitrocellulosa, essere macchiate con Ponceau S, essere tagliato con una lamierina di rasoio ed essere usato come antigene (cerchi i protocolli standard in SDS-PAGE).
• Elabori l'adiuvante completo di 1.1.ml Freund con un ago ipodermico 20G, quindi elabori 1.1 ml di soluzione dell'antigene. Congeli il 1.1 ml restanti per spinta.
• Mantenendo il nucleo mobile immobile, rimuova l'ago e fissi un rubinetto di chiusura sterile 3-way.
• Mescoli l'antigene con l'adiuvante fissando una seconda siringa di vetro al rubinetto di chiusura ed iniettando avanti e indietro. (attenzione: alcune siringhe di plastica hanno potuto reagire con l'olio minerale.)
• Un'emulsione completa sarà formata dopo circa 20-30 minuti; indicato tramite un aumento piuttosto improvviso nella viscosità della soluzione.

Attenzione: sia sicuro che il montaggio è sicuro!
• Dopo l'attesa di miscelazione circa 20 minuti prima dell'iniezione a controllo che la miscela è completa (se incompleto, l'olio separerà).
• Rada indietro di coniglio dalle lamierine della spalla al bacino.
• Pulisca indietro con l'etanolo o l'isopropanolo di 70%
• Inietti sotto la pelle in circa 10-20 lati lungo la spina fra la lamierina della spalla ed il bacino usando un ago ipodermico 21G. (nota: Prima iniezione una settimana dopo ultimo spurgo del preimmune).
• Attenda un mese ed amplifichi con una miscela dell'antigene e dell'adiuvante incompleto. Eviti le cicatrici dall'iniezione precedente.
• Sanguini dopo una settimana per controllare per vedere se c'è la immune-risposta. La spinta dovrebbe essere ripetuta, se la risposta immunitaria fosse troppo debole; tuttavia, un coniglio differente dovrebbe essere scelto, se il coniglio non reagisse affatto /LI >

Riferimenti: Garvey, J.S., Cremer, Nord-est, & Sussdorf, DH (1977) In: Metodi in immunologia. Pubblicazione. Benjamin Che Pubblica Azienda. Massa Delle Letture. pp 545

PARTE SUPERIORE

Selezione dell'anticorpo di Polyclonal usando analisi di ELISA

Protocollo di ELISA per lo schermo dell'anticorpo:

Materiali per ELISA:

piastre del ° - 96 pozzo Dynatech Immulon, tipo 2. (pescatore 17-0221-199).

° PBS, TBS

° PBS + 0.1% Tween 20 o TBS + 0.1% Tween 20.

° che ostruisce soluzione = 2% BSA (tipo V) in PBS. (aggiunga 0.02% azoturi per immagazzinaggio più di lunga durata.)

amplificatore di Elisa del ° = 2% BSA + 0.1% Tween 20 in PBS (azoturo facoltativo).

anticorpo del ° = perossidasi 1 del rafano collegati enzima

substrato del ° = ABTS - 100X (da Zymed 00-2001)1

amplificatore del ° HRP: acido citrico del magnesio del citrato pH 4.2(490 del Na di 100mM + citrato del Na del magnesio 720

biidrato + 50 ml H2O, pH 4.2).

perossido di idrogeno del ° 30% (1000X)

PARTE SUPERIORE

Protocollo di ELISA per l'anticorpo di Polyclonal

1) ADSORBTION DELL'ANTIGENE

a) AG diluito a 10 ug/ml in PBS.

b) Aggiunga bene l'UL 100 della soluzione dell'AG a ciascuno.

c) Lasci O.N coperto di involucro di saran, a 4°C.

2) OSTRUIRE

a) L'AG non legato della lavata invertendo le piastre e flicking i pozzi si asciuga.

b) Risciacquatura aggiungendo PBS a ciascuno pozzo ed invertendolo ancora (uso squirt la bottiglia).

c) Ripeti due volte la risciacquatura.

d) Aggiunga l'UL 100 di ostruire la soluzione all'ogni bene, lasci 1 ora alla temperatura ambiente o a O.N a 4°C.

3) ANTICORPO PRIMARIO

a) Aggiunga l'anticorpo da esaminare:

Sup delle cellule = UL 25, mescola bene pipeting su e giù (10 volte).

siero, ascite = 1:100 e un serie di 1/5 di diluzioni. Faccia le diluzioni nell'ostruire la soluzione.

b) Lasci 1 ora alla temperatura ambiente o a O.N a 4°C.

4) ANTICORPO SECONDARIO

a) Anticorpo non legato della lavata 4 volte con PBS + 0.1% Tween 20.

b) Aggiunga l'UL 100 dell'anticorpo collegato enzima a tutti i pozzi. Faccia le diluzioni adatte nell'amplificatore di Elisa. (ex: HRP è 2000X).

c) Lasci 1 ora alla temperatura ambiente o a O.N a 4°C.

5) SUBSTRATO

a) Substrato di Disolve in acqua.

b) Piastra della lavata 4 volte con PBS + 0.1% Tween 20 (uso TBS anziché PBS per il AP).

c) Aggiunga l'UL 100 del substrato ad ogni pozzo.

d) Guardi lo sviluppo di colore. Ciò ha potuto prendere da alcuni secondi a 20 minuti.

e) Se avuto bisogno di, arresti la reazione aggiungendo un'UL 50 del NacOh di 4M.

assorbimento colto di f) nel lettore di Elisa alla lunghezza d'onda corretta (per il sistema 416 nm di HRP, per il AP - 405 nm).

PARTE SUPERIORE

Altri Web site Dell'Anticorpo

Veda che stazione dell'anticorpo è un nuovo luogo che riguarda gli anticorpi, i fornitori dell'anticorpo ed altre informazioni anticorpo-relative.

Trovi altri anticorpo e soggetti monoclonal attinenti dell'anticorpo qui: