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The Molecular Station Guide to Western Blotting Problems and Solutions: Common Western Blot Problems and Solutions for them! इस गाइड को पश्चिमी आण्विक स्टेशन सोख्ता समस्याएं और समाधान : वेस्टर्न ब्लाट सामान्य समस्याओं और उनके समाधान के लिए !
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Membrane is Glowing in the Dark Room झिल्ली के अंधेरे में है Glowing कक्ष
High Background उच्च पृष्ठभूमि
Too many Bands in Western Blot वेस्टर्न ब्लाट में बहुत अधिक बैंड
Troubleshooting Western Blots Problem: विघ्ननिवारण पश्चिमी Blots समस्या :
Spots on Film (missing bands) : स्पॉट पर फिल्म ( गायब बैंड ) :
- Poor Transfer due to air bubbles during transfer to membrane -- स्थानांतरण खराब होने के कारण हवाई बुलबुलों के दौरान स्थानांतरण करने के लिए झिल्ली
- dirty film when adding to the developer -- जब गंदे फिल्म निर्माता को जोड़ने
- developer rolls are dirty -- रोल डेवलपर हैं गंदे
Solution to spots on film: समाधान स्थलों पर फिल्म :
- use a pasteur pipette as a roller. -- का उपयोग पाश्चर पिपेट रोलर के रूप में . roll the membrane and gel before transfer to remove bubbles. रोल की झिल्ली और हस्तांतरण से पहले जेल बुलबुलों को दूर करने के लिए . keep membrane and materials wet. झिल्ली सामग्री रखने और गीले .
- keep film clean before adding to the developer -- स्वच्छ रखने में जोड़ने से पहले फिल्म के निर्माता
Troubleshooting Western Blots Problem: विघ्ननिवारण पश्चिमी Blots समस्या :
Too Many Bands in Western Blot : बैंड में बहुत अधिक पश्चिमी ब्लाट :
- usually due to many non-specific bands -- आमतौर पर होने के कारण बहुत से गैर विशिष्ट बैंड
- poor primary antibody quality or old antibody -- गरीब प्राथमिक एंटीबॉडी गुणवत्ता या पुराने एंटीबॉडी
- not enough blocking -- पर्याप्त नहीं अवरुद्ध
- proteolytic cleavage of antigen - all additional bands are lower MW than your protein, ( ie your protein is being detected but was degraded) -- proteolytic दरार की प्रतिजन -- सभी अतिरिक्त मेगावाट की तुलना में कम बैंड हैं आपके प्रोटीन , ( यानी अपने प्रोटीन का पता लगाया जा रहा है लेकिन था अवक्रमित )
Solutions to too many bands on western blot: समाधान करने के लिए बहुत अधिक पश्चिमी बैंड पर धब्बा :
- purchase another antibody or replace with a fresh antibody stock -- खरीद एंटीबॉडी या किसी अन्य जगह के साथ एक नए शेयर एंटीबॉडी
- block with 5% dry non-fat milk or BSA prior to adding primary. -- 5 % ब्लॉक के साथ गैर शुष्क दूध या वसा BSA जोड़ने से पहले प्राथमिक . If you are already blocking, consider blocking during primary and secondary antibody incubations and also increasing blocking milk or BSA concentration. यदि आप पहले ही रोकने के विचार रोकने के दौरान प्राथमिक और माध्यमिक incubations एंटीबॉडी भी बढ़ रही है और दूध या अवरुद्ध BSA एकाग्रता है .
- keep everything on ice, use fresh samples, store in - 80C, and use protease inhibitors such as PMSF -- सब कुछ रखने पर बर्फ का उपयोग करें ताजा के नमूने , स्टोर में -- 80C , और उपयोग protease inhibitors जैसे PMSF
Troubleshooting Western Blots Problem: विघ्ननिवारण पश्चिमी Blots समस्या :
High background; low signal to noise ratio on Western Blot उच्च पृष्ठभूमि ; कम करने के लिए संकेत रव अनुपात पर पश्चिमी ब्लाट
- black or every dark film; film was exposed too long -- हर काले काले या फिल्म , फिल्म थी उजागर बहुत लंबा है
- blocking was insufficient ; non-specific binding of primary antibody and secondary antibodies were not washed completely -- अवरुद्ध था अपर्याप्त है ; गैर विशिष्ट बंधन में प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी एंटीबॉडी नहीं थे पूरी तरह से धोकर
- washing was insufficient -- धोने अपर्याप्त थी
- film glows in dark! -- फिल्म में काले glows ! - too high secondary or primary dilutions -- बहुत उच्च माध्यमिक या प्राथमिक dilutions
Solutions to Dark Film: समाधान करने के लिए काली फिल्म :
- expose for less time, decrease exposure time -- कम समय के लिए खोलना , जोखिम कम समय
- increase blocking duration of non-fat dry milk 5% incubation or increase the concentration. -- वृद्धि रोकने की अवधि के गैर वसा शुष्क दूध 5 % की वृद्धि हुई है या सेना एकाग्रता है .
- also you can try blocking with whole serum of the host animal with (or before) the secondary antibody -- आप भी रोकने की कोशिश कर सकते हैं सीरम के साथ पूरे होस्ट के साथ पशु ( या पहले ) माध्यमिक एंटीबॉडी
- increase washing times and volumes to help remove any non-specific signal due to weak antibody binding. -- धोने गुना वृद्धि हुई है और किसी भी मात्रा में मदद करने के लिए गैर विशिष्ट हटाने के संकेत के कारण कमजोर एंटीबॉडी बाध्यकारी है .
- using a stronger detergent to wash - Instead of TBST (Tween-20), use stronger detergents such as NP-40 or SDS which may provide a more stringent wash and reduce background (do this only if you band is strong! - washing also removes some your band of interest!) -- द्रव्य का उपयोग करने के लिए एक मजबूत धो -- TBST के बजाय ( मध्य - 20 ) का उपयोग करें मजबूत डिटर्जेंट जैसे NP - 40 प्रदान कर सकता है जो एक या SDS धो और अधिक कठोर और कम पृष्ठभूमि ( बैंड यदि आप ऐसा ही मजबूत है ! -- धोने से भी कुछ को हटा अपने बैंड ब्याज ! )
- very high secondary antibody (or even primary) concentration - perform optimization experiments to determine proper antibody dilutions. -- बहुत ही उच्च माध्यमिक एंटीबॉडी ( प्राथमिक या ) एकाग्रता -- प्रदर्शन को निर्धारित करने के लिए समुचित प्रयोग अनुकूलन एंटीबॉडी dilutions . dilute the antibodies further. कमजोर एंटीबॉडी के आगे है .
Troubleshooting Western Blots Problem: विघ्ननिवारण पश्चिमी Blots समस्या :
Low Signal or Weak Signal कम या सिग्नल कमज़ोर सिग्नल
- due to not enough protein loaded on the gel -- प्रोटीन के कारण पर्याप्त नहीं लोड पर जेल
- primary antibody is old or not good -- प्राथमिक एंटीबॉडी है या नहीं पुराने अच्छा
- phospho-proteins usually need overnight primary antibody incubation -- phospho - आमतौर पर प्रोटीन की जरूरत है रातोंरात प्राथमिक एंटीबॉडी सेना
- not enough secondary antibody -- पर्याप्त नहीं माध्यमिक एंटीबॉडी
- over-blocking -- ऊपर रोकने
- developing reagents are bad / you made a mistake when preparing them -- विकासशील हैं अभिकर्मकों खराब / गलती है जब आप उन की तैयारी
Solutions to Low Signal or Weak Signal : समाधान करने के लिए कम या सिग्नल कमज़ोर सिग्नल :
- load more protein sample onto gel -- भार अधिक प्रोटीन के नमूने पर जेल
- try fresh primary antibody -- नए सिरे से प्रयास करें प्राथमिक एंटीबॉडी
- incubate primary antibody overnite for phosphoproteins at 4 degrees C (cold room shaker) -- सेने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी overnite से 4 डिग्री phosphoproteins सी ( ठंडे shaker कमरा )
- increase concentration of protein (lyse samples in less lysis buffer) -- एकाग्रता बढ़ाने के प्रोटीन ( lyse नमूनों में कम lysis बफर )
- decrease concentration of blocking agent -- एकाग्रता की कमी अवरुद्ध एजेंट
- check the developing reagents; prepare fresh ECL and re-ECL the membrane -- विकासशील की जाँच अभिकर्मकों ; और फिर से तैयार ताजा ईसीएल ईसीएल की झिल्ली
- increase the concentration or the length of primary antibody incubation period -- एकाग्रता बढ़ाने के प्राथमिक या लंबाई एंटीबॉडी सेना की अवधि
- increase concentration or the length of secondary antibody incubation period -- या एकाग्रता बढ़ाने की लंबाई माध्यमिक एंटीबॉडी सेना की अवधि
Fuzzy Bands, Bands Smeared, Bands not Sharp फजी बैंड , बैंड फुलके , तीव्र नहीं बैंड
- bands smeared due to hot gel -- फुलके बैंड के कारण गर्म जेल
- bands fuzzy due to high voltage -- बैंड fuzzy के कारण उच्च वोल्टेज
Solutions to Fuzzy bands and Un-sharp Bands: समाधान करने के लिए फजी बैंड और संयुक्त राष्ट्र के तीखे बैंड :
- decrease voltage or current, run in cold room, and prepare new running buffer. -- कम वोल्टेज या वर्तमान , सर्दी में चलने के कमरे में चल रहा है और नए बफर तैयार है . ( heat causes the gel to lose its rigidity and its resolving power) ( गर्मी के कारण जेल को खो अपनी कठोरता और उसके समाधान शक्ति )
- pre-soak transfer membrane in the appropriate transfer solution (determined by the membrane manufacturer) for the required length of time. -- पूर्व सोख हस्तांतरण के हस्तांतरण के झिल्ली में उचित समाधान ( द्वारा निर्धारित की झिल्ली निर्माता ) की लंबाई के लिए समय की आवश्यकता है .
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