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Protein Purification प्रोटीन शुद्धीकरण

Copyright 2006 Molecular Station कॉपीराइट 2006 आण्विक स्टेशन

Protein purification is vital in the characterisation of your protein of interest. शुद्धीकरण महत्वपूर्ण है प्रोटीन में अपने विशिष्ट वर्णन के प्रोटीन की रुचि है . Purification of your protein allows one to study the function of the protein, and its enzymatic activity. शुद्धीकरण की अनुमति देता है आपके एक प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए इस समारोह के प्रोटीन , और उसके एंजाइमी गतिविधि है . Stuctural information from the protein can also be obtained from purified proteins including NMR, 3-D information such as protein crystallization. Stuctural जानकारी के प्रोटीन से भी किया जा सकता है जिनमें से प्राप्त प्रोटीन शुद्ध एनएमआर , 3 डी सूचना जैसे प्रोटीन crystallization .

So how does one go about purifying a protein? इसलिए करता है कि कैसे एक शुट्ठ जाने के बारे में एक प्रोटीन है ?

Proteins can be purified according to size, solubility, Charge and Binding affinity प्रोटीन की जा सकती है शुद्ध आकार के अनुसार , विलेयता , प्रभारी और बाध्यकारी आकर्षण

Proteins can readily be visualized and differentiated by electrophoresis methods.  Theses gel techniques can also be used to obtain small quantities (micrograms) of purified polypeptides.  However, they do not provide large amounts of purified proteins in their native state.  Substantial quantities of purified proteins, of the order of many milligrams, are needed to elucidate fully their three-dimensional structure and their mechanism of action.  Several thousand proteins have been purified in active form on the basis of such characteristics as size, solubility, charge and specific binding affinity.  At each step in purification, the preparation is assayed for a distinctive property of the protein of interest (eg enzymatic activity) to assess the efficacy of the procedure. प्रोटीन कल्पना कर सकते हैं और आसानी से किया जा विभेदित विधियों द्वारा वैद्युतकणसंचलन . Theses जेल तकनीकों का इस्तेमाल किया जा सकता है प्राप्त करने के लिए कम मात्रा ( micrograms ) के शुद्ध polypeptides . हालांकि , वे नहीं प्रदान बड़ी मात्रा में शुद्ध प्रोटीन में अपने राज्य के मूल निवासी . पर्याप्त मात्रा में शुद्ध प्रोटीन , के आदेश के कई मिलीग्राम , पूरी तरह से स्पष्ट करने की आवश्यकता अपने तीन आयामी संरचना और उनके तंत्र की कार्रवाई की है . कई हजार प्रोटीन की गई है शुद्ध रूप में सक्रिय के आधार पर इस तरह की विशेषताओं के रूप में आकार , विलेयता , प्रभारी और विशिष्ट बंधन आकर्षण है . इस समय हर कदम में शुद्धीकरण , assayed के लिए तैयार है संपत्ति के एक विशिष्ट प्रोटीन का ब्याज ( जैसे एंजाइमी गतिविधि ) की प्रभावकारिता के मूल्यांकन करने के लिए प्रक्रिया है .

Proteins can be separated from small molecules by dialysis through a semi-permeable membrane, such as cellulose membrane with pores.  Molecules having dimensions significantly greater than the pore diameter are retained inside the dialysis bag, wwhereas smaller molecules and ions traverse the pores of such a membrane and emerge in the dialysis outside the bag. छोटे से अलग किया जा सकता है प्रोटीन अणुओं के द्वारा एक अर्द्ध डायलिसिस के माध्यम से पारगम्य झिल्ली , जैसे सेल्यूलोज झिल्ली के साथ pores . अणुओं के पास से अधिक महत्वपूर्ण आयाम हैं pore व्यास के भीतर रखा डायलिसिस बैग , wwhereas आयनों और छोटे अणुओं की यात्रा ऐसे pores झिल्ली में उभरने और डायलिसिस बैग के बाहर है .

More discriminating separation on the basis of size can be achieved by the technique of gel-filtration chromatography.  The sample is applied to the top of the column consisting of porous beads made of an insoluble but highly hydrated polymer such as dextran or agarose (which are carbohydrates) or polyacrylamide.  Sephadex, Sepharose, and Bio-gel are commonly used commercial preparations of these beads, which are typically 100 micrometers in diameter.  Small molecules can enter these beads but large ones cannot.  The result is that small molecules are distributed both in the aqueous solution inside the beads and between them, whereas large molecules are located only in the solution between the beads.  Large molecules flow more rapidly through this column and emerge first, because a smaller volume is accessible to them.  It should be noted that the order of emergence of molecules from a column of porous beads is the reverse of the order in gel electrophoresis, in which a continuous polymer framework impedes the movement of large molecules.  Much larger quantities of protein can be separated by gel filtration chromatography than by gel electrophoresis but at the price of lower resolution. अधिक भेदभाव के आधार पर अलग आकार के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है जेल की तकनीक का निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी . नमूना है लागू करने के लिए कॉलम के ऊपर की छिद्रित के मनकों की बनी हुई है लेकिन एक अत्यंत अघुलनशील hydrated बहुलक जैसे dextran या agarose ( जो कर रहे हैं कार्बोहाइड्रेट ) या polyacrylamide . Sephadex , Sepharose , और जैव जेल की तैयारी कर रहे हैं सामान्यतः वाणिज्यिक इन मनकों का इस्तेमाल किया है , जो आमतौर 100 micrometers में व्यास हैं . मनकों इन छोटे अणुओं प्रविष्ट कर सकते हैं लेकिन बड़ी नहीं कर सकते हैं . नतीजा यह है कि दोनों छोटे अणुओं वितरित किए जाते हैं जलीय में समाधान के भीतर और उनके बीच मनकों , जबकि बड़े अणुओं में ही स्थित हैं मनकों के समाधान के बीच है . बड़े अणुओं के प्रवाह के माध्यम से इस कॉलम और अधिक तेजी से उभर पहले , क्योंकि एक छोटी मात्रा उन से सुलभ है . है कि यह ध्यान दिया जाना चाहिए इस आदेश के उद्भव के अणुओं से एक कॉलम के मनकों छिद्रित है रिवर्स वैद्युतकणसंचलन जेल के क्रम में , जिसमें एक सतत बहुलक ढांचे की बड़ी बाधा के आंदोलन के अणुओं . काफी बड़ी मात्रा में प्रोटीन द्वारा अलग किया जा सकता है जेल की तुलना में निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी द्वारा जेल लेकिन वैद्युतकणसंचलन की कीमत कम संकल्प है .

The solubility of most proteins is lowered at high salt concentrations.  This effect, called salting out, is very useful, though not well understood.  The dependence of solubility on salt concentration differs from one protein to another.  Hence salting out can be used to fractionate proteins.  Salting out is also useful for concentrating dilute solutions of proteins. विलेयता है इस प्रोटीन के सबसे कम मात्रा में नमक अधिक है . यह प्रभाव , नमकीन बनाना कहा जाता है , बहुत उपयोगी है , हालांकि अच्छा नहीं समझा . विलेयता पर नमक की निर्भरता के एकाग्रता से दूसरे से भिन्न एक प्रोटीन है . इसलिए निमकाई से बाहर करने के लिए प्रयोग किया जा सकता है fractionate प्रोटीन है . निमकाई से बाहर भी उपयोगी प्रोटीन के समाधान के लिए ध्यान कमजोर है .

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