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Western Blotting Protocol पश्चिमी सोख्ता प्रोटोकॉल

Western-blot protocol पश्चिमी धब्बा प्रोटोकॉल

Preparation of Samples for SDS-PAGE Gel Electrophoresis from Prepared Cell Lysates सैम्पल के लिए तैयार SDS पृष्ठ जैल वैद्युतकणसंचलन से तैयार सेल Lysates

1. Prepare gels for SDS-PAGE gels के लिए तैयार SDS पृष्ठ
2. Prepare 1X running buffer 1X की तैयारी चल रहे बफर
3. Add 50 mL of beta-mercaptoethanol to 950 ml sample buffer (for 1 mL). जोड़ें 50 मिलीग्राम बीटा mercaptoethanol को मिली 950 नमूने बफर ( 1 एम एल के लिए ) . (only if you have not pre-added beta-mercaptoethanol to sample buffer) ( केवल यदि आपके पास पहले से नहीं जोड़ा बीटा mercaptoethanol को नमूने के बफर )
4. Add sample buffer to each sample (pre-determine how much sample you can load per well - BioRad thin combs can retain about 30uL. Large combs can accomate up to 50uL). नमूना जोड़ें बफर प्रत्येक नमूना ( पूर्व निर्धारित कर सकते हैं आप कितना भार नमूना प्रति अच्छा -- BioRad पतली combs बनाए रखने के बारे में 30uL कर सकते हैं . combs बड़े accomate तक 50uL कर सकते हैं ) .
5. Vortex samples briefly. संक्षेप में Vortex नमूनों .
6. Poke a hole in cap of each tube (to prevent the tops popping when boiling) मुटल्ली एक छेद में से प्रत्येक की टोपी ट्यूब ( चोटियों को रोकने के गटक जब क्वथन )
7. Boil in heating block/water bath at (95°C) for 5 minutes (lower temperatures have been shown to prevent non-specific protein aggregation) उबाल में गर्म ब्लॉक / जल में स्नान ( 95 ° C ) के लिए 5 मिनट ( कम तापमान को रोकने के लिए प्रदर्शित किया गया है अविशिष्ट प्रोटीन एकत्रीकरण )

After Boiling Protein Samples - Loading and Running the SDS-PAGE Gel क्वथन नमूनों के बाद प्रोटीन -- लोड हो रहा है और चलाने का SDS पृष्ठ का जैल

1. Centrifuge samples for 1 minute at high speed. Centrifuge नमूनों के लिए 1 मिनट पर उच्च गति है .
2. Load sample into each lane. लोड में प्रत्येक लेन का नमूना है .
3. Load MW (molecular weight ladder) reference. लोड मेगावाट ( आण्विक भार सीढ़ी ) के संदर्भ में . (you may want ( आप चाहें
4. Run gel at 100V (100V through stacking gel, voltage can be increased up to 200V when running in separating gel with plenty of running buffer) जेल चलाने पर 100V ( 100V के माध्यम से जेल stacking , वोल्टेज तक बढ़ाया जा सकता है 200V चल रहा है जब जेल में अलग से खूब चल रहे बफर )

Transfer of Protein Samples to Membrane स्थानांतरण के लिए प्रोटीन के लिए सैम्पल झिल्ली

1. Prepare 1X Transfer buffer 1X तैयार स्थानांतरण बफर
2. Soak and shake gel in Transfer buffer for 15 min सोख हिला और 15 जेल में स्थानांतरण के लिए न्यूनतम बफर
3. Soak nitrocellulose membrane (or PVDF) and filter paper (extra thick) for several minutes. सोख nitrocellulose झिल्ली ( या PVDF ) और फिल्टर पेपर ( अतिरिक्त मोटी ) के लिए कई मिनट .
4. Place sandwich on transfer cell: सैंडविच पर स्थानान्तरण प्लेस सेल :

Extra thick filter paper CLEAR अतिरिक्त मोटी फिल्टर पेपर साफ़
Membrane झिल्ली
Gel जैल
Extra thick filter paper BLACK काले रंग की मोटी अतिरिक्त फिल्टर पेपर

5. Electric transfer: 35V overnite or 90V for 1 hour depending on the size of your protein or your patience! इलेक्ट्रिक हस्तांतरण : 35V overnite या 90V के लिए 1 घंटे के आकार के आधार पर अपने प्रोटीन या आपके धैर्य !

Western Blotting Protocol or Immunoblotting सोख्ता प्रोटोकॉल या पश्चिमी Immunoblotting

1. Prepare 1X TBST from stock solutions. स्टॉक 1X TBST से तैयार समाधान है .
2. Prepare blocking buffer (3% Bovine Serum Albumin or 5% Blotting-grade milk (Blotto) in TBST). अवरुद्ध तैयार बफर ( 3 % 5 % या गोजातीय सीरम Albumin सोख्ता ग्रेड के दूध ( मदहोश ) में TBST ) . (you may want to try several different blocking times and conditions). ( आप चाहें तो अलग रोकने की कोशिश में कई बार और शर्तों ) .
3. Wash membrane in 1X TBST with shaking for 10 min. धोएँ झिल्ली में 1X TBST झटकों के साथ 10 मिनट के लिए .
4. Block at room temperature for 1 hour with blocking buffer (shaking or circular rotator) ब्लॉक के कमरे के तापमान पर रोकने के लिए 1 घंटे से बफर ( या झटकों के परिपत्र rotator )
5. Incubate your membrane (PVDF or nitrocellulose) with primary 1° Ab antibody overnight (for difficult blotting conditions ie phosphorylation of proteins) or 1 hour for ( easy conditions such as total protein) at 4°C (overnite) or room temperature (1 hour incubation only) covered with saran wrap (gentle shaking). सेने अपने झिल्ली ( PVDF या nitrocellulose ) के साथ प्राथमिक 1 ° अब रातोंरात एंटीबॉडी ( सोख्ता के लिए कठिन परिस्थितियों यानी प्रोटीन के phosphorylation ) या 1 घंटे के लिए ( जैसे आसान शर्तों के कुल प्रोटीन ) से 4 डिग्री सेल्सियस ( overnite ) या कमरे के तापमान ( 1 घंटे केवल सेना ) के साथ शामिल सरन कपड़े ( नम्र झटकों ) . You can use plastic tubs from the dollar store for this (use these only for blotting!) or use pipette box bottoms. प्लास्टिक का उपयोग कर सकते हैं आप tubs से डॉलर के इस भंडार के लिए ( सिर्फ प्रयोग के लिए इन सोख्ता ! ) का उपयोग करें या पिपेट बॉक्स बॉटम . The dilution for primary antibody is around 1:1000. यह छूट के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी 1:1000 के आसपास है . See manufacturer's instructions. निर्माता के निर्देश देखें .
6. Wash with 1X TBST  3 X 15 min 3 एक्स 1X TBST धोएँ के साथ 15 मिनट
7. Incubate your membrane (PVDF or nitrocellulose) with secondary antibody, 2° Ab for 30 – 45 min or (1 hour - for difficult blotting conditions) at room temperature. सेने अपने झिल्ली ( PVDF या nitrocellulose ) के साथ माध्यमिक एंटीबॉडी , 2 ° के लिए अब 30 -- 45 मिनट या ( 1 घंटा -- सोख्ता के लिए कठिन परिस्थितियों ) के कमरे के तापमान पर है . The dilution for secondary antibodies is usually 1:10,000 or higher. यह छूट के लिए आमतौर पर माध्यमिक एंटीबॉडी 1:10000 या अधिक है . (ie 1uL of secondary in 10mL of TBST per membrane) See manufacturer's instructions.  You may want to add your antibody to blocking solution to decrease non-specific binding especially if you got high background in your first experiment. ( यानी 1uL के माध्यमिक में 10mL के प्रति TBST झिल्ली ) के निर्माता के निर्देश देखें . हो सकता है आप जोड़ना चाहते हैं आपके प्रतिपिण्ड का अवरुद्ध समाधान को कम करने के लिए विशेष रूप से बाध्यकारी अविशिष्ट यदि आप उच्च मिला पृष्ठभूमि में आपका पहला प्रयोग है .
8. Wash with TBST   4-5 X 10 min. धोएँ के साथ 10 मिनट X TBST 4-5 . This is the most important washing step. सबसे महत्वपूर्ण यह है धोने कदम है .
9. ECL (5min) ईसीएल ( 5min )
10. Expose to film. पर्दाफाश करने के लिए फिल्म है . Usually exposure time of western blots is about 10-30 seconds. आमतौर पर समय के प्रदर्शन के बारे में 10-30 सेकेंड पश्चिमी blots है . Longer (5-10 minutes) for phosphorylation. समय ( 5-10 मिनट तक ) के लिए phosphorylation . If you have a really weak signal, either you need to load more protein or try to increase exposure time (up to 30 minutes - you can try leaving it in a casette longer). यदि आपके पास वास्तव में एक संकेत कमजोर है , या तो आपको लोड करने के लिए और अधिक प्रोटीन या प्रदर्शन को बढ़ाने का प्रयास करें समय ( 30 मिनट तक -- आप इसे छोड़ने का प्रयास कर सकते हैं कैसेट में अब ) .
11. Keep your membrane! झिल्ली अपने रखें ! You can keep your membrane in TBST 1X in the fridge for a while. आप अपने झिल्ली में TBST 1X में फ्रिज समय के लिए . You may need it for the following reasons: 1) checking loading (paper reviewers may ask for total protein or a loading standard such as actin). यह आप की आवश्यकता हो सकती है के लिए निम्नलिखित कारणों से है : 1 ) की जाँच लोड ( कागज समीक्षक कुल प्रोटीन के लिए कह सकता है या इस तरह के मानक के रूप में लोड actin ) . Also, you can probe initially for a phospho-protein and then strip and reprobe for total protein. इसके अलावा , आप जांच शुरू कर सकते हैं phospho के लिए प्रोटीन और फिर पट्टी और कुल reprobe के लिए प्रोटीन है .

Also see our Western Blotting Membrane Stripping Protocol इसके अलावा हमारे देखने के पश्चिमी सोख्ता झिल्ली स्ट्रिपिंग प्रोटोकॉल