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Bradford Protein Assay Protocol ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख प्रोटोकॉल

Protein Concentration Determinatino using the Bradford Assay Method प्रोटीन एकाग्रता परख Determinatino विधि का प्रयोग कर ब्रैडफोर्ड

Materials for Bradford Assay ब्रैडफोर्ड सामग्री के लिए परख

1. 1 . Reagent: The assay reagent is made by dissolving 100 mg of Coomassie Blue G250 in 50 mL of 95% ethanol. अभिकर्मक : परख अभिकर्मक द्वारा बनाई जाती है dissolving 100 मिलीग्राम की Coomassie ब्लू G250 में 50 मिलीग्राम इथेनॉल 95 % है . The solution is then mixed with 100 mL of 85% phosphoric acid and made up to 1 L with distilled water. इसका समाधान तो 100 एम एल के साथ मिश्रित फॉस्फोरिक एसिड के 85 % से 1 से बना है और आसुत जल के साथ एल . The reagent should be filtered through Whatman no. अभिकर्मक के माध्यम से छान वाटमैन कागज नहीं किया जाना चाहिए . 1 filter paper and then stored in an amber bottle at room temperature. 1 फिल्टर पेपर और फिर भंडारित एम्बर बोतल में एक कमरे के तापमान पर है . It is stable for several weeks. यह कई सप्ताह के लिए स्थिर है . However, during this time dye may precipitate from solution and so the stored reagent should be filtered before use. लेकिन , इस समय के दौरान रंजक precipitate से समाधान हो सकता है और इसी के संग्रहीत अभिकर्मक छान से पहले का उपयोग किया जाना चाहिए .

2. 2 . Protein standard . प्रोटीन मानक है . Bovine γ-globulin at a concentration of 1 mg/mL (100 µg/mL for the microassay) in distilled water is used as a stock solution. गोजातीय γ में एकाग्रता की globulin - 1 मिलीग्राम / एम एल ( 100 μ g / एम एल के लिए microassay ) में आसुत जल स्टॉक समाधान के रूप में प्रयोग किया जाता है . This should be stored frozen at –20oC. यह फ्रोजन पर संग्रहीत किया जाना चाहिए - 20oC . Since the moisture content of solid protein may vary during storage, the precise concentration of protein in the standard solution should be determined from its absorbance at 280 nm. चूंकि नमी सामग्री के भंडारण के दौरान ठोस प्रोटीन भिन्न हो सकते हैं , एकाग्रता की सटीक प्रोटीन में मानक निर्धारित से हल किया जाना चाहिए उसके absorbance पर 280 एनएम . The absorbance of a 1 mg/mL solution of γ-globulin, in a 1-cm light path, is 1.35. इस absorbance की 1 मिलीग्राम / एम एल के समाधान के globulin γ , 1 सेमी प्रकाश में एक पथ , 1,35 है . The corresponding values for two alternative protein standards, bovine serum albumin and ovalbumin, are 0.66 and 0.75, respectively. इसी के मूल्यों के लिए प्रोटीन के दो विकल्प मानकों , गोजातीय सीरम albumin और ovalbumin , 0,66 हैं और 0,75 , क्रमशः .

3. 3 . Plastic and glassware used in the assay should be absolutely clean and detergent free. और प्लास्टिक की परख glassware में प्रयुक्त किया जाना चाहिए और द्रव्य मुक्त बिल्कुल साफ है . Quartz (silica) spectrophotometer cuvettes should not be used, as the dye binds to this material. क्वार्टज ( सिलिका ) spectrophotometer cuvettes इस्तेमाल नहीं करना चाहिए , क्योंकि इस सामग्री को बांधे रंजक है . Traces of dye bound to glassware or plastic can be removed by rinsing with methanol or detergent solution. जोधपुर के रंजक करने के लिए बाध्य glassware द्वारा हटाया जा सकता है या प्लास्टिक के साथ rinsing मेथनॉल द्रव्य या समाधान है .

Standard Bradford Assay Method मानक तरीका ब्रैडफोर्ड परख

1. 1 . Pipet between 10 and 100 µg of protein in 100 µL total volume into a test tube. Pipet के बीच 10 और 100 μ g के μ एल कुल 100 में प्रोटीन की मात्रा को एक टेस्ट ट्यूब . If the approximate sample concentration is unknown, assay a range of dilutions (1, 1:10, 1:100, 1:1000). यदि लगभग अज्ञात नमूना एकाग्रता है , परख कई dilutions ( 1 , 1:10 , 1:100 , 1:1000 ) . Prepare duplicates of each sample. डुप्लिकेट प्रत्येक नमूना तैयार है .

2. 2 . For the calibration curve, pipet duplicate volumes of 10, 20, 40, 60, 80, and 100 µL of 1 mg/mL γ-globulin standard solution into test tubes, and make each up to 100 µL with distilled water. अंशांकन वक्र के लिए , pipet डुप्लिकेट मात्रा में 10 , 20 , 40 , 60 , 80 , 100 और एल के μ 1 मिलीग्राम / एम एल γ globulin मानक के समाधान में परीक्षण नलियों , और प्रत्येक को 100 μ आसुत जल के साथ एल . Pipet 100 µL of distilled water into a further tube to provide the reagent blank. 100 एल Pipet μ आसुत के पानी को एक और ट्यूब की अभिकर्मक प्रदान करने के लिए खाली है .

3. 3 . Add 5 mL of protein reagent to each tube and mix well by inversion or gentle vortexmixing. 5 एम एल जोड़ें प्रोटीन अभिकर्मक प्रत्येक ट्यूब और अच्छा मिश्रण द्वारा व्युत्क्रमण या नम्र vortexmixing . Avoid foaming, which will lead to poor reproducibility. foaming से बचें , जिससे गरीब को reproducibility का नेतृत्व करेंगे .

4. 4 . Measure the A595 of the samples and standards against the reagent blank between 2 min and 1 h after mixing. मापने के नमूनों के A595 और मानकों के खिलाफ अभिकर्मक के बीच खाली 1 और 2 मिनट के बाद h मिश्रण है . The 100 µg standard should give an A595 value of about 0.4. 100 μ g के एक मानक देना चाहिए A595 मूल्य के बारे में 0,4 . The standard curve is not linear, and the precise absorbance varies depending on the age of the assay reagent. वक्र रैखिक मानक नहीं है , और सटीक की आयु के आधार पर अलग अलग absorbance की परख अभिकर्मक . Consequently, it is essential to construct a calibration curve for each set of assays. नतीजतन , यह जरूरी है अंशांकन एक वक्र का निर्माण करने के लिए प्रत्येक सेट assays .

Microassay Method This form of the assay is more sensitive to protein. Microassay के फार्म का तरीका यह है परख करने के लिए प्रोटीन के प्रति अधिक संवेदनशील है . Consequently, it is useful when the amount of the unknown protein is limited (see also Note 9). नतीजतन , यह उपयोगी है जब अज्ञात प्रोटीन की मात्रा तक सीमित है ( देखें भी नोट 9 ) . 1. 1 . Pipet duplicate samples containing between 1 and 10 µg in a total volume of 100 µL into 1.5-mL polyethylene microfuge tubes. डुप्लिकेट के नमूनों के बीच Pipet जिनमें 1 और 10 μ g में कुल मात्रा में 1.5 - 100 μ एल एम एल polyethylene microfuge नलियों . If the approximate sample concentration is unknown, assay a range of dilutions (1, 1:10, 1:100, 1:1000). यदि लगभग अज्ञात नमूना एकाग्रता है , परख कई dilutions ( 1 , 1:10 , 1:100 , 1:1000 ) .

2. 2 . For the calibration curve, pipet duplicate volumes of 10, 20, 40, 60, 80, and 100 µL of 100 µg/mL γ-globulin standard solution into microfuge tubes, and adjust the volume to 100 µL with water. अंशांकन वक्र के लिए , pipet डुप्लिकेट मात्रा में 10 , 20 , 40 , 60 , 80 , 100 और 100 के μ एल μ g / एम एल γ globulin मानक के समाधान में microfuge नलियों , और समायोजित करने के लिए की मात्रा 100 μ एल के साथ पानी की है . Pipet 100 µL of distilled water into a tube for the reagent blank. 100 एल Pipet μ आसुत के पानी को एक ट्यूब के लिए अभिकर्मक रिक्त है .

3. 3 . Add 1 mL of protein reagent to each tube and mix gently, but thoroughly. 1 एम एल जोड़ें प्रोटीन अभिकर्मक प्रत्येक ट्यूब और धीरे मिश्रण है , लेकिन पूरी तरह है .

4. 4 . Measure the absorbance of each sample between 2 and 60 min after addition of the protein reagent. प्रत्येक absorbance मापने के 2 और नमूने के बीच 60 मिनट के बाद प्रोटीन के अलावा अभिकर्मक . The A595 value of a sample containing 10 µg γ-globulin is 0.45. इस A595 मूल्य के एक नमूना जिसमें 10 μ g - globulin γ 0,45 है .

see also: Bradford Protein Assay इन्हें भी देखें : ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख

References for Bradford Assay संदर्भ के लिए ब्रैडफोर्ड परख

Modified from protocol by Nicholas J. Kruger. निकोलस द्वारा संशोधित प्रोटोकोल से क्रूगर जे .

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