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Protein and Antibody Microarrays प्रोटीन और एंटीबॉडी Microarrays
Detection Methods and Non-specific Binding गैर विशिष्ट पहचान तरीके और बाध्यकारी
Non-specific binding to the array needs to be minimized and this is typically done by immersing the arrays in a bovine serum albumin based buffer (BSA) (31). गैर विशिष्ट सरणी के लिए बाध्य करने की जरूरत है और कम से कम यह आमतौर आपनी के द्वारा किया arrays में गोजातीय सीरम albumin आधारित बफर ( BSA ) ( 31 ) .
Analyte-binding and retention on protein arrays proceeds via thermodynamically driven binding mechanism similar to the hybridization of nucleic acid targets to probes. However, the detection of bound targets to proteins is considerably more complex than that of DNA microarray detection (9). Currently a variety of detection methods are being examined. For example, ELISA was first used to detect proteins for both filter arrays (66,67) and glass arrays (68). विश्लेष्य पदार्थ और बनाए रखने के बंधन पर प्रोटीन arrays आय के द्वारा संचालित thermodynamically बाध्य करने के लिए इसी तरह की व्यवस्था की संकरण nucleic एसिड की जांच करने के लिए लक्ष्य है . हालांकि , इस प्रोटीन का पता लगाने के लिए बाध्य है लक्ष्य की तुलना में काफी अधिक जटिल है कि पता लगाने के डीएनए माइक्रोएरे ( 9 ) . वर्तमान में एक विभिन्न प्रकार के तरीकों का पता लगाने की जांच की जा रही हैं . उदाहरण के लिए , एलिसा पहली बार दोनों के लिए प्रोटीन का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता फिल्टर arrays ( 66,67 ) और ग्लास arrays ( 68 ) . ELISA based detection methods have the disadvantage of non-specificity of protein-antibody interactions, leading to many false positives. Radioisotope labeling was used by Ge et al. (22), radioisotope labeling to study protein–protein, protein–DNA, protein–drug interactions on filter arrays. Zhu et al. used radioisotope labeling to conduct kinase assays of different substrates by using purified yeast kinase proteins on a array (36). The preferred method of detection is fluorescence detection because these methods are generally safe, extremely sensitive, simple and can have very high resolution. These detection methods are also compatible with standard microarray scanners. एलिसा आधारित तरीकों का पता लगाने का नुकसान न होने की विशिष्टता एंटीबॉडी चर्चा के प्रोटीन , जिससे कई झूठे सकारात्मक है . रेडियोआइसोटोप लेबलिंग एट अल जीई के द्वारा प्रयोग किया जाता था . ( 22 ) , लेबलिंग रेडियोआइसोटोप प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए प्रोटीन , प्रोटीन डीएनए , प्रोटीन मादक पदार्थों पर चर्चा के फिल्टर arrays . झू एट अल . आचरण करने के लिए प्रयोग किया जाता रेडियोआइसोटोप लेबलिंग kinase assays विभिन्न substrates का उपयोग करके शुद्ध खमीर kinase प्रोटीन पर सरणी ( 36 ) . की पसंद का पता लगाने की पद्धति का पता लगाने प्रतिदीप्ति है क्योंकि ये आमतौर पर सुरक्षित तरीके हैं , अत्यंत संवेदनशील , सरल और संकल्प बहुत अधिक हो सकती है . इन तरीकों का पता लगाने का भी मानक माइक्रोएरे स्कैनर के साथ संगत है . Generally, a chip is either directly probed with a fluorescent molecule (eg a fluorescently labeled protein or small molecule, by using a tagged probe (eg biotin), which can then be detected in a second step using a fluorescently labeled affinity reagent (eg streptavidin) (16,56). Another fluorescent labeling method is rolling circle amplification (RCA), which is also extremely sensitive (32). सामान्यतया , एक चिप है या तो सीधे जांच के साथ एक अणु फ्लोरोसेंट ( जैसे एक छोटे से fluorescently लेबल या प्रोटीन अणुओं , जांच का उपयोग करके एक पताका ( जैसे बायोटिन ) , जो किया जा सकता है एक दूसरे चरण में पता चला fluorescently लेबल का प्रयोग करते हुए एक आकर्षण अभिकर्मक ( जैसे streptavidin ) ( 16,56 ) . फ्लोरोसेंट लेबलिंग एक और तरीका है चक्र चल प्रवर्धन ( RCA ) है , जो भी अत्यंत संवेदनशील ( 32 ) .
Although the proteomes under comparison can be labeled in a comparable fashion with fluorophores, the reproducibility of these chemical reactions is poor and interference with the protein-antibody interactions presents an additional complexity (9). यद्यपि proteomes के तहत किया जा सकता है लेबल की तुलना में एक फैशन के साथ तुलनीय fluorophores , reproducibility इन गरीब है और रासायनिक प्रतिक्रियाओं के हस्तक्षेप के साथ चर्चा के प्रोटीन एंटीबॉडी प्रस्तुत एक अतिरिक्त जटिलता ( 9 ) . Also, non-uniform labeling of proteins can be addressed by performing a dual-colour ratiometric assay, where an internal standard is present for each target protein which is measured (9). इसके अलावा , गैर समान लेबल के प्रोटीन का प्रदर्शन कर सम्बोधित किया जा सकता है दोहरी रंग ratiometric परख है , जहां एक आंतरिक है वर्तमान मानक के लिए प्रोटीन है जो लक्ष्य प्रत्येक मापा ( 9 ) . A disadvantage of labeling proteins with fluorophores is a reduction of the quantitative accuracy of the assay, as incorporation of the label may alter the binding properties of the proteins (9). एक नुकसान के लेबल के साथ प्रोटीन की कमी है fluorophores मात्रात्मक परख की सटीकता , लेबल के रूप में शामिल करने के लिए बाध्य हो सकती है बदलने के गुणों के प्रोटीन ( 9 ) .
Although direct protein labeling detection methods are still widely used, the intrinsic problems mentioned has resulted in the increasing use of label free detection methods for protein microarrays. These methods are mass spectrometry (MS), atomic force microscopy (AFM) (70), and surface plasmon resonance (SPR) (71). यद्यपि प्रत्यक्ष प्रोटीन का पता लगाने लेबलिंग तरीके अभी भी व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है , के परिणामस्वरूप आंतरिक समस्याओं का उल्लेख किया गया है लेबल के बढ़ते उपयोग के तरीकों का पता लगाने के लिए प्रोटीन से मुक्त microarrays . तरीके हैं ये मास स्पेक्ट्रोमेट्री ( एमएस ) , परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी ( AFM ) ( 70 ) , और सतह plasmon अनुनाद ( SPR ) ( 71 ) .
Non-labeling methods have advantages as a direct detection approach for antibody microarrays since labeling molecules affects protein activity. गैर लाभ के रूप में लेबलिंग तरीके हैं प्रत्यक्ष दृष्टिकोण का पता लगाने के लिए प्रतिपिण्ड microarrays के बाद से लेबलिंग गतिविधि प्रोटीन अणुओं को प्रभावित करता है . SELDI (surface-enhanced laser desorption/ionization) mass spectrometry has been used to detect low-density arrays of captured proteins (69). SELDI ( सतह से बढ़ाकर लेजर desorption / ionization ) मास स्पेक्ट्रोमेट्री का पता लगाने के लिए प्रयोग किया गया है arrays कम घनत्व का कब्जा प्रोटीन ( 69 ) . Proteins are captured on a metal surface array (SELDI protein array) and are vapourized using a laser beam. Analysis using mass spectrometry data is then performed in order to reveal the identities of these proteins. प्रोटीन धातु की सतह पर कब्जा कर लिया सरणी ( SELDI प्रोटीन सरणी ) और एक का उपयोग कर रहे हैं vapourized लेजर बीम . विश्लेषण मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया है उसके बाद में पता चलता है की पहचान करने के लिए इन प्रोटीन है .
Atomic force microscopy (AFM) method uses surface topological changes to identify the captured proteins on an antibody array (70). परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी ( AFM ) विधि का उपयोग करता है सतह topological परिवर्तनों का पता लगाने के लिए प्रोटीन पर कब्जा कर लिया एंटीबॉडी सरणी ( 70 ) . When rabbit IgG is immobilized on a gold surface and binds to its complimentary antibodies, goat ant-rabbit IgG, AFM detects the increase in height, and thus is able to measure binding interactions. However in order to study the kinetics of antigen–antibody interactions, real-time detection methods will be useful. खरगोश आईजीजी है जब एक सोने की सतह पर immobilized बांधे और अपने मानार्थ एंटीबॉडी , बकरी , खरगोश आईजीजी चींटी , AFM ऊँचाई में वृद्धि का पता लगाता है , और इस प्रकार है बाध्यकारी चर्चा के उपाय करने में सक्षम है . हालांकि करने के लिए अध्ययन के kinetics प्रतिपिण्ड प्रतिजन के पारस्परिक संपर्क , वास्तविक समय तरीकों का पता लगाने में उपयोगी होगी . Surface plasmon resonance (SPR) has matured into a versatile detection tool to study the kinetics of receptor–ligand interactions with a wide range of molecular weights, affinities and binding rates (72-74). भूतल plasmon अनुनाद ( SPR ) ने परिपक्व में एक बहुमुखी उपकरण का पता लगाने के अध्ययन के लिए kinetics - ligand रिसेप्टर की पारस्परिक संपर्क के साथ एक व्यापक श्रेणी के आणविक भार है , और बाध्यकारी affinities दर ( 72-74 ) . Commercial SPR chips are available however their detection resolution is limited. A sensor surface with 64 individual immobilization sites in a single flow cell was developed (75). An antibody array biosensor was also developed to study the kinetics of antigen binding using a planar waveguide as the detection method. वाणिज्यिक SPR उपलब्ध हैं लेकिन उनके चिप्स का पता लगाने के प्रस्ताव तक सीमित है . सेंसर की सतह के साथ एक व्यक्तिगत स्थिरीकरण 64 साइटों में एक ही प्रवाह कोशिका विकसित किया गया था ( 75 ) . एंटीबॉडी एक भी विकसित किया गया था biosensor सरणी के अध्ययन के लिए बाध्यकारी kinetics प्रतिजन के एक का उपयोग कर के रूप में तलीय waveguide पता लगाने की विधि है . Using this method, the group demonstrated that significant signal intensity could be achieved from spots as small as 200 mm in diameter. इस विधि का प्रयोग है , समूह में दिखा दिया है कि महत्वपूर्ण संकेत प्राप्त किया जा सकता है तीव्रता से धब्बे के रूप में छोटे रूप में 200 मिमी व्यास . It is therefore expected that this approach will be suitable for high-throughput and parallel kinetics studies. इसलिए यह उम्मीद है कि इस दृष्टिकोण के लिए उपयुक्त होगा throughput और उच्च अध्ययन के समानांतर kinetics . (76). ( 76 ) .
Range of Detection रेंज की पहचान
Another difference between protein and DNA microarrays is that protein concentrations in a single biological sample or cells are several orders of magnitute greater than that for mRNAs. Thus protein chip detector systems must have a very large range of detection operation – up to a factor of 1014, compared to 104 for mRNA. Thus an antibody with nanomolar affinity to a particular target will be saturated by the presence of this target at micromolar concentrations and will fail to detect pico- or femtomolar target levels. Thus accommodating rare and abundant proteins will probably require separate arrays (7,8,9). एक अन्य प्रोटीन और डीएनए microarrays के बीच अंतर यह है कि एक ही प्रोटीन की मात्रा में जैविक नमूने हैं या कोशिकाओं के कई आदेश magnitute से अधिक के लिए कि mRNAs . प्रोटीन चिप डिटेक्टर प्रणालियां इस प्रकार होना चाहिए एक बहुत बड़ी सीमा का पता लगाने के ऑपरेशन -- अप करने के लिए 1014 में एक कारक , 104 की तुलना में mRNA के लिए . प्रतिपिण्ड के साथ इस प्रकार का एक nanomolar करने के लिए एक विशेष आकर्षण का लक्ष्य होगा संतृप्त द्वारा इस लक्ष्य की उपस्थिति में विफल हो जाएंगी और micromolar गैसों का पता लगाने के लिए पिको या femtomolar स्तर लक्ष्य है . समायोजन दुर्लभ और इस प्रकार शायद प्रचुर मात्रा में प्रोटीन की जरूरत होगी अलग arrays ( 7,8,9 ) .
Multiple antibodies with varying affinities for the target may be positioned at different areas of the array however studies have shown that only 20% of arrayed antibodies provide measurements of proteins at low concentrations (33). एकाधिक एंटीबॉडी के साथ अलग हो सकता है affinities के लक्ष्य के लिए विभिन्न क्षेत्रों में स्थिति के अध्ययन से पता चला है कि सरणी लेकिन केवल 20 % के arrayed एंटीबॉडी प्रदान प्रोटीन कम मात्रा के मापन ( 33 ) .
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References for Protein and Antibody Microarrays संदर्भ के लिए प्रोटीन और एंटीबॉडी Microarrays
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Introduction and Background to Protein Chips and Antibody Chips. परिचय और पृष्ठभूमि के लिए प्रोटीन चिप्स और एंटीबॉडी चिप्स .
Types of Antibody and Protein Chips चिप्स और प्रोटीन के प्रकार एंटीबॉडी
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