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Successful PCR Conditions सफल पीसीआर शर्तें

Parameters for Successful PCR पैरामीटर के लिए सफल पीसीआर

Are you having problems of achieving a successful PCR?  Many factors can affect your outcome of your PCR such as: Metal Ion Cofactors, Substrate and Substrate Analogs, Buffers and Salts and Cosolvents.  Also Thermal Cycling Considerations:  PCR Vessels, Temperature and Time Optimization, PCR Amplification Cycles, Enzyme/Target and Hot Start. क्या आप को प्राप्त करने की समस्या हो रही एक सफल पीसीआर ? कई कारकों के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं अपने अपने पीसीआर जैसे : आयन Cofactors धातु , और सब्सट्रेट Analogs सब्सट्रेट , Buffers और साल्ट और Cosolvents . संबंधी बातें भी थर्मल साइकल चालन : पीसीआर वेसल्स , तापमान और समय अनुकूलन , पीसीआर प्रवर्धन चक्र , एनजाइम / लक्ष्य और गर्म प्रारंभ है .

Metal Ion Cofactors and PCR आयन Cofactors धातु और पीसीआर

An essential cofactor for the DNA polymerase in PCR is Magnesium chloride.  Its concentration must be optimized for every primer:template system. डीएनए के लिए एक आवश्यक cofactor पोलीमरेज़ पीसीआर में मैगनीशियम क्लोराइड है . एकाग्रता होना चाहिए इसके लिए हर अनुकूलित प्रथम : टेम्प्लेट प्रणाली है . Many components of the reaction bind magnesium ion, including primers, template, PCR products and dNTPs. कई घटकों की प्रतिक्रिया बाध्य आयन मैग्नीशियम , जिनमें प्राइमरों , टेम्पलेट , पीसीआर उत्पादों और dNTPs . The main 1:1 binding agent for magnesium ion is the high concentration of dNTPs in the reaction. 1:1 का मुख्य एजेंट के लिए बाध्यकारी है मैग्नीशियम आयन उच्च dNTPs में एकाग्रता की प्रतिक्रिया होती है . Because it is necessary for free magnesium ion to serve as an enzyme cofactor in PCR, the total magnesium ion concentration must exceed the total dNTP concentration. के लिए आवश्यक है क्योंकि यह मुक्त मैग्नीशियम आयन एंजाइम की सेवा के रूप में cofactor पीसीआर , मैग्नीशियम की कुल आयन एकाग्रता की कुल dNTP एकाग्रता से अधिक होनी चाहिए . Typically, to start the optimization process, 1.5 mM magnesium chloride is added to PCR in the presence of 0.8 mM total dNTPs. आमतौर पर , शुरू करने के लिए अनुकूलन प्रक्रिया में , 1,5 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड करने के लिए कहा है पीसीआर की उपस्थिति में कुल 0,8 मिमी dNTPs . This leaves about 0.7 mM free magnesium for the DNA polymerase. पत्तियों के बारे में यह 0,7 मिमी मुक्त मैग्नीशियम के लिए डीएनए पोलीमरेज़ . In general, magnesium ion should be varied in a concentration series from 1.5–4.0 mM in 0.5 mM steps. सामान्य तौर पर , मैग्नीशियम आयन किया जाना चाहिए विविध में एकाग्रता की श्रृंखला में 0,5 एम एम एम एम 1.5-4.0 से कदम है .

Substrates and Substrate Analogs for PCR Substrates और Analogs सब्सट्रेट के लिए पीसीआर

The DNA polymerases incorporate very efficiently dNTPs.  They also can incorporate modified substrates, when they are used as supplemental components in PCR. यह बहुत ही डीएनए polymerases कुशलतापूर्वक dNTPs शामिल है . संशोधित substrates वे भी शामिल कर सकते हैं , जब वे हैं पीसीआर में घटकों के पूरक के रूप में प्रयोग किया जाता है . Examples of substrates used for DNA polymerase are: Digoxigenin-dUTP, biotin-11-dUTP, dUTP, c7deaza-dGTP, and fluorescently labeled dNTPs. substrates डीएनए के उदाहरण के लिए इस्तेमाल किया पोलीमरेज़ हैं : Digoxigenin - dUTP , बायोटिन - 11 - dUTP , dUTP , c7deaza - dGTP , और fluorescently लेबल dNTPs . For conventional PCR, the concentration of dNTPs remains balanced in equimolar ratios, eg, 200 μM each dNTP. परंपरागत के लिए पीसीआर , dNTPs की एकाग्रता बनी हुई है संतुलित equimolar अनुपात में , जैसे , 200 एम μ प्रत्येक dNTP . Also note that, deviations from these standard recommendations may be beneficial in certain amplications. यह भी ध्यान दें कि , मानक दिशा से इन सिफारिशों में कुछ amplications फायदेमंद हो सकता है . For example, when random mutagenesis of a specific target is desired, unbalanced dNTP concentrations promote a higher degree of misincorporations by the DNA polymerase. उदाहरण के लिए , जब एक विशिष्ट यादृच्छिक mutagenesis के वांछित लक्ष्य है , असंतुलित dNTP बढ़ावा देने के एक उच्च स्तर की सांद्रता misincorporations द्वारा डीएनए पोलीमरेज़ .

Buffers and Salts for PCR Buffers और साल्ट के लिए पीसीआर

Depending on the DNA polymerase used the optimal PCR buffer concentration, salt concentration, and pH should be picked accordingly to the DNA polymerase. डीएनए के आधार पर पोलीमरेज़ इष्टतम उपयोग किया है पीसीआर बफर एकाग्रता , नमक एकाग्रता , और तदनुसार पीएच को चुना जाना चाहिए डीएनए पोलीमरेज़ . The PCR buffer for Taq DNA polymerase consists of 50 mM KCl and 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, at room temperature. इस पीसीआर बफर Taq के लिए डीएनए पोलीमरेज़ में 50 मिमी KCl और 10 मिमी की Tris एचसीएल , पीएच 8,3 , कमरे के तापमान पर है . This buffer provides the ionic strength and buffering capacity needed during the reaction. यह बफर प्रदान करता है आयोनी बफरन शक्ति और क्षमता के दौरान प्रतिक्रिया की आवश्यकता है . It is important to note that the salt concentration affects the Tm of the primer:template duplex, and hence the annealing temperature. ध्यान दें कि यह महत्वपूर्ण है नमक की एकाग्रता को प्रभावित करता है Tm के प्रथम : द्वैध टेम्प्लेट है , और इसलिए annealing के तापमान है .

Cosolvents

Different PCR Cosolvents are used to increase the yield, efficacy, and specificity of PCR amplifications. विभिन्न पीसीआर का उपयोग किया जाता है Cosolvents उपज बढ़ाने के लिए , प्रभावकारिता , और विशिष्टता के पीसीआर amplifications . These cosolvents can be advantageous in some amplifications, and disadvantageous in other amplifications. ये cosolvents में कुछ amplifications लाभप्रद हो सकता है , और दूसरे में अलाभकारी amplifications . It is impossible to predict which additive will be useful for each primer:template duplex and therefore the cosolvent must be empirically tested for each combination. यह भविष्यवाणी करना असंभव है जो प्रत्येक के लिए उपयोगी होगा additive प्रथम : टेम्प्लेट द्वैध cosolvent होना चाहिए और इसलिए empirically परीक्षण के लिए प्रत्येक संयोजन है .

Thermal Cycling Considerations थर्मल साइकल चालन संबंधी बातें

PCR Vessels पीसीआर वेसल्स

PCR must be performed in vessels that are compatible with low amounts of enzyme and nucleic acids and that have good thermal transfer characteristics. पीसीआर होना चाहिए प्रदर्शन में जहाजों के साथ संगत है कि कम मात्रा में होते हैं और एंजाइम nucleic एसिड और अच्छा हो कि थर्मल हस्तांतरण विशेषताएं हैं . Usually, polypropylene is used for PCR vessels and conventional, thick-walled microcentrifuge tubes are chosen for many thermal cycler systems. आमतौर पर , polypropylene पीसीआर जहाजों के लिए प्रयोग किया जाता है और पारंपरिक , मोटी नलियों की दीवारों microcentrifuge हैं थर्मल cycler कई सिस्टम के लिए चुना है . PCR is most often performed at a 10–100 μL reaction scale and requires the prevention of the evaporation/condensation processes in the closed reaction tube during thermal cycling. सबसे अधिक बार प्रदर्शन किया है पीसीआर पर 10-100 μ एल प्रतिक्रिया की आवश्यकता होती है और बड़े पैमाने पर की रोकथाम के वाष्पीकरण / संघनन प्रक्रियाओं में बंद के दौरान थर्मल साइकिल ट्यूब प्रतिक्रिया है . A mineral oil overlay or wax layer serves this purpose. खनिज तेल या उपरिशायी मोम की एक परत इस उद्देश्य सेवा करता है . More recently, 0.2-mL thin-walled vessels have been optimized for the PCR process and oil-free thermal cyclers have been designed that use a heated cover over the tubes held within the sample block. अभी हाल ही में मिली 0.2 पतली वाहिकाओं की दीवारों के लिए अनुकूलित किया गया है पीसीआर प्रक्रिया है और तेल से मुक्त थर्मल cyclers उद्देश्य से डिज़ाइन किया गया है कि गर्म का उपयोग कवर की नलियों के भीतर आयोजित ब्लॉक नमूना है .

Temperature and Cycle Time Optimization तापमान और समय चक्र अनुकूलन

It is essential that the reaction mixtures reach the denaturation, annealing, and extension temperatures in each thermal cycle. यह आवश्यक है कि इस मिश्रण तक पहुँचने की प्रतिक्रिया विकृतीकरण , annealing , विस्तार और तापमान में प्रत्येक चक्र तापीय . If insufficient hold time is specified at any temperature, the temperature of the sample will not be equilibrated with that of the sample block. यदि अपर्याप्त पकड़ में निर्दिष्ट किसी भी समय है तापमान , तापमान का नमूना नहीं होगा कि equilibrated के साथ नमूना के खंड . Some thermal cycler designs time the hold interval based on the block temperature, whereas others base the hold time on predicted sample temperature. ताप cycler कुछ समय के डिजाइन के आधार पर रोक अंतराल ब्लॉक के तापमान , जबकि अन्य लोगों के पास समय के आधार पर भविष्यवाणी के तापमान का नमूना है . If a conventional thick-walled tube used in a cycler controlled by block temperature, a 60-s hold time is sufficient for equilibration. यदि एक पारंपरिक मोटी ट्यूब की दीवारों में प्रयुक्त ब्लॉक एक cycler द्वारा नियंत्रित तापमान , एक 60 s संतुलन रखने के लिए पर्याप्त समय है . Extra time may be recommended at the (72°C) extension step for longer PCR products. अतिरिक्त समय में सिफारिश की जा सकती है ( 72 ° C ) पीसीआर अब उत्पादों के विस्तार के लिए कदम है . Using a thin-walled 0.2-mL tube in a cycler controlled by predicted sample temperature, only 15 s is required. एक पतली की दीवारों का प्रयोग 0.2 - एम एल ट्यूब में एक भविष्यवाणी की नमूना cycler द्वारा नियंत्रित तापमान में से केवल 15 s आवश्यक है . To use existing protocols or to development protocols for use at multiple laboratories, it is very important to choose hold times according to the cycler design and tube wall thickness. या मौजूदा का उपयोग करने के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए विकास के लिए प्रोटोकॉल पर कई प्रयोगशालाओं , यह बहुत महत्वपूर्ण है चुनने के लिए धारण के समय के अनुसार cycler डिजाइन और ट्यूब की दीवार मोटाई .

PCR Amplification Cycle Number पीसीआर प्रवर्धन साइकिल की संख्या

The number of PCR amplification cycles should be optimized with respect to the starting concentration of the target DNA. पीसीआर की संख्या में प्रवर्धन चक्र के संबंध में की जानी चाहिए अनुकूलित करने के लिए शुरू की एकाग्रता के डीएनए का लक्ष्य है . It is recommended that, from 40– 45 cycles to amplify 50 target molecules, and 25–30 cycles to amplify 3 × 105 molecules to the same concentration. यह अनुशंसा की जाती है कि , में से 40 -- 45 चक्र को amplify 50 अणु लक्ष्य है , और 25-30 चक्र को amplify 3 × 105 अणुओं की इसी एकाग्रता है . This non-proportionality is caused by a so-called plateau effect, in which a decrease in the exponential rate of product accumulation occurs in late stages of a PCR. यह गैर proportionality कारण होता है एक तथाकथित पठार प्रभाव , जिसमें एक घातीय की दर में कमी के उत्पाद के संचय में देर होती है चरणों में एक पीसीआर . This may be caused by degradation of reactants (dNTPs, enzyme); reactant depletion (primers, dNTPs); end-product inhibition (pyrophosphate formation); competition for reactants by non-specific products; or competition for primer binding by reannealing of concentrated (10 nM) product. यह पतन का कारण हो सकता है reactants ( dNTPs , एंजाइम ) ; reactant रिक्तीकरण ( प्राइमरों , dNTPs ) ; अंतिम उत्पाद संदमन ( pyrophosphate गठन ) ; प्रतियोगिता के लिए reactants द्वारा गैर विशिष्ट उत्पादों ; या प्रतियोगिता के लिए बाध्य किया reannealing के प्रथम केंद्रित ( 10 एनएम ) उत्पाद है . It is usually advisable to run the minimum number of cycles needed to see the desired specific product, because unwanted nonspecific products will interfere if the number of cycles is excessive. आमतौर पर यह सलाह दी जाती को चलाने के लिए न्यूनतम आवश्यकता चक्र संख्या में देखने के लिए वांछित विशिष्ट उत्पाद है , क्योंकि अवांछित nonspecific उत्पादों में हस्तक्षेप करेगा यदि चक्र की संख्या अत्यधिक है .

Enzyme / Target एनजाइम / लक्ष्य

In a standard aliquot of Taq DNA polymerase used for a 100-μL reaction, there are about 1010 molecules. अशेष भाजक में एक मानक के Taq पोलीमरेज़ डीएनए के लिए प्रयोग किया जाता 100 -- एल प्रतिक्रिया μ , 1010 अणुओं के बारे में हैं . Each PCR sample should be evaluated for the number of target copies it contains or may contain. प्रत्येक पीसीआर नमूना किया जाना चाहिए मूल्यांकन के लिए लक्ष्य की संख्या में हो सकती है या इसमें प्रतियां . For example, 1 ng of lambda DNA contains 1.8 × 107 copies. उदाहरण के लिए , 1 वॉल्यूम lambda के डीएनए में 1,8 × 107 प्रतियां . For low-input copy number PCR, the enzyme becomes limiting and it may be necessary to give the extension process incrementally more time. प्रतिलिपि संख्या कम निवेश के लिए पीसीआर , एंजाइम को सीमित हो जाता है और यह आवश्यक हो सकता है देने के लिए और अधिक समय के विस्तार की प्रक्रिया बढा . Thermal cyclers can reliably perform this automatic segment extension procedure in order to maximize PCR yield. थर्मल cyclers प्रदर्शन कर सकते हैं विश्वस्त इस प्रक्रिया में स्वत : खंड विस्तार करने के लिए पीसीआर अधिकतम उपज है .

Hot Start Conditions हॉट शर्तों आरंभ

All of the above optimizations also apply to a PCR that is designed, from the beginning, with a hot start method. सभी के अनुकूलन के ऊपर भी लागू करने के लिए डिज़ाइन किया गया है कि एक पीसीआर से की शुरुआत के साथ शुरू गरम विधि है . Often, a hot start can be incorporated successfully into a previously optimized PCR without changing the reaction conditions. अक्सर , एक गरम शुरू में शामिल किया जा सके सफलतापूर्वक पहले अनुकूलित पीसीआर परिवर्तित किये बिना प्रतिक्रिया की स्थिति है . However, it usually pays to reoptimize after adding a hot start. लेकिन , यह भुगतान करने के लिए आमतौर पर एक गर्म reoptimize जोड़ने के बाद शुरू . Optimization is often a balance between producing as much product as possible and overproducing nonspecific, background amplifications. अनुकूलन से होती है , एक के बीच संतुलन के रूप में अधिक उत्पादन संभव हो और उत्पाद के रूप में overproducing nonspecific , पृष्ठभूमि amplifications . Because hot start greatly reduces background amplifications, the upper restraints are raised on conditions such as enzyme concentration, cycle number, and metal ion cofactor concentration. क्योंकि गर्म शुरू amplifications पृष्ठभूमि बहुत कम है , के ऊपरी restraints उठाए हैं पर इस तरह की स्थितियों के रूप में एंजाइम एकाग्रता , चक्र नंबर , धातु और आयन cofactor एकाग्रता है . Sensitive PCRs that have been highly tuned without a hot start may fail when a hot start is added. PCRs किया गया है कि अत्यधिक संवेदनशील गुडी के बिना असफल हो सकता है जब एक गरम गरम शुरू शुरू में जोड़ा है . This can be caused by slight delays in early cycles caused by mixing or enzyme activation. कारण यह हो सकता है मामूली चक्र के शुरू में देरी के कारण या एंजाइम सक्रियण का मिश्रण है . The PCR usually can be restored, often with substantial increase in specific product, by simply increasing limiting parameters or reagents. इस पीसीआर आमतौर पर बहाल किया जा सकता है , अक्सर के साथ विशिष्ट उत्पाद में काफी वृद्धि हुई है , बस द्वारा मानकों को सीमित या अभिकर्मकों बढ़ रही है . In addition, there are optimizations specific to each hot start method. इसके अतिरिक्त , विशिष्ट हैं अनुकूलन शुरू करने के लिए प्रत्येक पद्धति के गर्म है . Mixing or enzyme activation can be affected by PCR volume, buffer composition and pH, cosolvents, cycling conditions, and so on. सक्रियण का मिश्रण किया जा सकता है या एंजाइम की मात्रा से प्रभावित पीसीआर , बफर संरचना और पीएच , cosolvents , साइकिल चालन की स्थिति , आदि . The specific product’s literature, often a product insert, should be consulted for information on these considerations. इस विशिष्ट उत्पाद के साहित्य , अक्सर एक उत्पाद डालें , परामर्श के लिए किया जाना चाहिए इन विचारों के बारे में जानकारी .