home > pcr > history-of-pcr > index.php घर > पीसीआर > इतिहास के पीसीआर > index.php
 |
|---|
 |  |  |  |  | |
|---|---|---|---|---|---|
PCR Protocols पीसीआर प्रोटोकॉल | PCR Bioinformatics and Databases और पीसीआर Bioinformatics डेटाबेस | Learn about PCR पीसीआर के बारे में जानें | PCR Kits and Products और पीसीआर किटों उत्पाद | PCR Forum पीसीआर फोरम | PCR Books पीसीआर पुस्तकें |
Also visit PCR Station इसके अलावा यात्रा पीसीआर स्टेशन
Copyright 2006 MolecularStation कॉपीराइट 2006 MolecularStation
Polymerase Chain Reaction - PCR पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन -- पीसीआर
Table of Contents : टेबल के अनुक्रमणिका :
Introduction to PCR - Polymerase Chain Reaction परिचय पीसीआर -- पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन
Polymerase Chain Reaction (PCR) पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन ( पीसीआर )
PCR, a Concept to be Discovered पीसीआर , एक अवधारणा को खोज
General Principles of the PCR सामान्य सिद्धांतों के पीसीआर
Polymerases/Reaction Specificity and Efficiency Polymerases / रिएक्शन विशिष्टता और दक्षता
Utility of PCR उपयोगिता पीसीआर
PCR and Molecular Cloning और पीसीआर आण्विक का क्लोनिंग
Misincorporation: Errors of In Vitro Systems Misincorporation : विट्रो में सिस्टम की त्रुटियाँ
Reaction Specificity रिएक्शन विशिष्टता
Major Advantages of PCR as a Cloning Method include its Rapidity, Sensitivity, and Robustness मेजर लाभ के पीसीआर विधि का क्लोनिंग के रूप में शामिल अपने शीघ्रता , संवेदनशीलता , और दृढ़ता
Limitations of PCR सीमाओं के पीसीआर
Instruments for PCR उपकरण के लिए पीसीआर
Oligonucleotide Synthesis Oligonucleotide संश्लेषण
Will PCR ever be replaced? क्या कभी पीसीआर की जगह है ? – Helicase-dependent Amplification (HDA) -- Helicase निर्भर प्रवर्धन ( HDA )
More than 30 years ago, the introduction of recombinant DNA technology as a tool for the biological sciences revolutionized the study of life. Molecular cloning allowed the study of individual genes of living organisms; however this technique was dependent on obtaining a relatively large quantity of pure DNA. This depended on the replication of the DNA of plasmids or other vectors during cell division of microorganisms (1). Researchers found it extremely laborious and difficult to obtain a specific DNA in quantity from the mass of genes present in a biological sample (2). Recombinant DNA technology made possible the first molecular analysis and prenatal diagnosis of several human diseases. Fetal DNA obtained by amniocentesis sampling could be analyzed by restriction enzyme digestion, electrophoresis, southern transfer and hybridization to a cloned gene or oligonucleotide probes (3). However, southern blotting permitted only rudimentary mapping of genes in unrelated individuals (4). 30 से भी अधिक साल पहले की शुरुआत के रिकॉम्बीनेंट डीएनए तकनीक के लिए एक उपकरण के रूप में जैविक विज्ञान क्र ांतिकारी परिवर्तन के अध्ययन के जीवन है . आण्विक क्लोनिंग की अनुमति के अध्ययन के रहने वाले व्यक्ति के जीन जीवधारी , लेकिन इस तकनीक पर निर्भर था प्राप्त करने का एक अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में शुद्ध डीएनए . इस पर निर्भर दोहराने के डीएनए के plasmids या अन्य सूक्ष्म जीवाणुओं की प्रक्रिया कोशिकाओं के विभाजन के दौरान वैक्टर ( 1 ) . शोधकर्ताओं ने पाया है और यह बेहद कठिन परिश्रम प्राप्त करने के लिए एक विशिष्ट मात्रा में डीएनए से द्रव्यमान का जीन में मौजूद एक जैविक नमूने ( 2 ) . रिकॉम्बीनेंट डीएनए तकनीक के पहले संभव बनाया आण्विक विश्लेषण और मानव में कई रोगों के निदान के पूर्व . भ्रूण डीएनए नमूने एमनियोटिक फ्लूइड द्वारा प्राप्त किया जा सकता है विश्लेषण द्वारा प्रतिबंध एंजाइम पाचन , वैद्युतकणसंचलन , दक्षिणी और हस्तांतरण संकरण क्लोन करने के लिए एक या जीन oligonucleotide जांच ( 3 ) . लेकिन , दक्षिणी सोख्ता की अनुमति केवल अल्पविकसित मानचित्रण के जीन में असंबंधित व्यक्तियों ( 4 ) .
PCR, an acronym for Polymerase Chain Reaction (5,6), allowed the production of large quantities of a specific DNA from a complex DNA template in a simple enzymatic reaction. PCR is a recently developed procedure for the in vitro amplification of DNA. PCR has transformed the way that almost all studies requiring the manipulation of DNA fragments may be performed as a results of its simplicity and usefulness (7). पीसीआर , एक संक्षिप्त के लिए पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन ( 5,6 ) , के उत्पादन की अनुमति दी बड़ी मात्रा में एक विशिष्ट डीएनए से एक जटिल डीएनए टेम्पलेट में एक सरल एंजाइमी प्रतिक्रिया है . हाल ही में विकसित पीसीआर है विट्रो में प्रवर्धन प्रक्रिया के लिए डीएनए की है . पीसीआर जिस तरह से बदल गया है कि लगभग सभी अध्ययन की आवश्यकता हो सकती है टुकड़ों में हेरफेर डीएनए परिणामों के प्रदर्शन के रूप में अपनी सादगी और उपयोगिता ( 7 ) .
In the 1980s, Kary Mullis (Figure 1) and a team of researchers at Cetus Corporation at Cetus Corporation conceived of a way to start and stop a polymerase's action at specific points along a single strand of DNA. Mullis also realized that by harnessing this component of molecular reproduction technology, the target DNA could be exponentially amplified. This DNA amplification procedure was based on an in vitro rather than an in vivo process (5,6,8). Cell-free DNA amplification by PCR was able to simplify many of the standard procedures for cloning, analyzing, and modifying nucleic acids (1). Previous techniques for isolating a specific piece of DNA relied on gene cloning – a tedious and slow procedure. PCR, on the other hand Kerry Mullis stated “lets you pick the piece of DNA you’re interested in and have as much of it as you want” (2,8). सन् 1980 के दशक Kary Mullis ( चित्रा 1 ) और शोधकर्ताओं की एक टीम पर Cetus निगम में Cetus निगम की कल्पना की और शुरू करने के लिए एक तरह से रोकने की कार्रवाई में एक पोलीमरेज़ विशिष्ट अंक के साथ एक ही डीएनए का किनारा . Mullis भी जान लिया कि ईएमई द्वारा इस घटक आण्विक के प्रजनन प्रौद्योगिकी , डीएनए के लक्ष्य तीव्र विभेद किया जा सकता है . डीएनए यह प्रवर्धन प्रक्रिया पर आधारित था विट्रो में एक के बजाय एक vivo प्रक्रिया में ( 5,6,8 ) . सेल मुक्त डीएनए प्रवर्धन द्वारा पीसीआर को सरल बनाने में सफल कई मानक क्लोनिंग प्रक्रिया के लिए , विश्लेषण , और संशोधित nucleic एसिड ( 1 ) . पिछला तकनीकों के लिए अलग एक विशिष्ट टुकड़ा डीएनए पर भरोसा जीन क्लोनिंग -- एक धीमी प्रक्रिया है और थकाऊ . पीसीआर , दूसरी ओर केरी Mullis कहा " आपको चुनने की टुकड़ा डीएनए आप में रुचि के रूप में ज्यादा है और इसे आप चाहते हैं कि " ( 2,8 ) . When other Cetus scientists eventually succeeded in making the polymerase chain reaction perform as desired in a reliable fashion, they had an immensely powerful technique for providing essentially unlimited quantities of the precise genetic material molecular biologists and others required for their work (8). Since the first report in1985, more than 5000 scientific papers were published by 1992 (1). Furthermore, the large number of publications of course makes it impossible to review all the important contributions to the development and application of PCR technology; however we will attempt to review here the most important developments in the practice of basic PCR. जब अन्य वैज्ञानिकों Cetus अंततः सफल बनाने में पोलीमरेज़ चेन की प्रतिक्रिया के रूप में वांछित प्रदर्शन में एक विश्वसनीय फैशन , उन्हों ने एक बेहद शक्तिशाली तकनीक उपलब्ध कराने के लिए अनिवार्य रूप से असीमित की सटीक मात्रा में आणविक आनुवांशिक सामग्री और अन्य ऑडिशन के लिए आवश्यक अपने काम ( 8 ) . चूंकि पहली रिपोर्ट in1985 , 5000 से भी अधिक वैज्ञानिक पत्र प्रकाशित किए गए थे द्वारा 1992 ( 1 ) . इसके अलावा , बड़ी संख्या में प्रकाशन के पाठ्यक्रम की समीक्षा करने के लिए बनाता है असंभव सभी महत्वपूर्ण योगदान के लिए प्रौद्योगिकी विकास और अनुप्रयोग के पीसीआर , लेकिन हम कोशिश की समीक्षा करने के लिए यहाँ का सबसे महत्वपूर्ण घटनाक्रम में बुनियादी पीसीआर की प्रथा है .
PCR was thought to be conceived by Dr. Kerry Mullis in 1983 while working at the Cetus Corporation in Emeryville, CA. However, some pioneering work was also done by Gobind Khorana in 1971 who described a basic principle of replicating a piece of DNA using two primers. Progress then was limited by primer synthesis and polymerase purification issues (9). In Mullis’s head, the invention grew from a theoretical scheme to perform limited dideoxynucleotide sequencing of unique human genes using synthetic oligonucleotides for the purpose of diagnosing common human disease mutations. An obvious obstacle to such a direct sequencing strategy was the high complexity of the human genome (3.3 X 109 base pairs). Thus, a second oligonucleotide or primer was added to block the progression of the synthesis of the first primer. Later however, this second primer was included to bind to the other DNA strand, so that each strand of the mutant allele would contribute to the eventual signal. If the scheme involving simultaneous hybridization of primers to each strand was modified by heating the mixture and then repeating the annealing and extension steps, then the primary signal would be increased even further. Repeating the steps would enable the products of the first round to be duplicated in the second cycle, to yield two copies. Repeating the cycle again would result in four copies, et cetera . Several weeks passed before this great idea was attempted (8). Two primers were synthesized to be perfectly complementary to each end of the 110 base pair region of a cloned segment of the human b-globin gene, the amplification was performed, and the products were identified by acrylamide gel electrophoresis. The end result was the anticipated 110 base pair DNA fragment and the beginning of PCR as a basic technique in molecular biology (5,6). पीसीआर माना गया था संकल्पना के द्वारा 1983 में डॉ. Mullis केरी पर काम करते हुए Cetus निगम में Emeryville , CA . हालांकि , कुछ अग्रणी कार्य भी किया गया था गोविन्द Khorana जो 1971 में वर्णित एक बुनियादी सिद्धांत का एक टुकड़ा नकल करने के डीएनए का उपयोग कर दो प्राइमरों . प्रगति तब तक सीमित था और संश्लेषण द्वारा प्रथम पोलीमरेज़ शुद्धीकरण मुद्दों ( 9 ) . में Mullis के सिर , के आविष्कार से बढ़ी सैद्धांतिक प्रदर्शन करने की योजना का अनूठा सीमित dideoxynucleotide अनुक्रमण मानव जीन का प्रयोग कर सिंथेटिक oligonucleotides के उद्देश्य के लिए मानव आम रोग के निदान म्यूटेशन है . बाधा स्पष्ट करने के लिए एक ऐसी रणनीति प्रत्यक्ष अनुक्रमण था उच्च जटिलता के मानव जीनोम ( 3,3 एक्स बेस जोड़े 109 ) . इस प्रकार , या दूसरी oligonucleotide प्रथम खंड में जोड़ा गया प्रगति के संश्लेषण के पहले प्रथम है . लेकिन बाद में , यह दूसरी प्रथम शामिल करने के लिए बाध्य किया गया था डीएनए के अन्य किनारा है , ताकि हर किनारा के उत्परिवर्ती एलील संभावित संकेत के योगदान करेगा . यदि इस योजना को शामिल करने के लिए एक साथ संकरण के प्राइमरों प्रत्येक किनारा द्वारा संशोधित किया गया था और फिर गर्म करने के मिश्रण को दोहराने annealing चरणों का और विस्तार , तो प्राथमिक संकेत भी आगे बढ़ाया जाएगा . चरणों को दोहराने के उत्पादों को सक्षम करने के पहले दौर के दूसरे चक्र में दोहराया गया है , को उपज की दो प्रतियां . दोहराने के परिणाम को फिर से चक्र में चार प्रतियां , एट cetera . कई सप्ताह के पारित होने से पहले इस महान विचार का प्रयास किया था ( 8 ) . प्राइमरों दो पूरक थे संश्लेषित को पूर्णतः समाप्त करने के लिए प्रत्येक क्षेत्र में 110 आधार जोड़ी के एक क्षेत्र में मानव क्लोन b - globin जीन , प्रवर्धन प्रदर्शन किया था , और उत्पादों की पहचान के द्वारा जेल acrylamide वैद्युतकणसंचलन . अंतिम परिणाम था प्रत्याशित 110 जोड़ी आधार डीएनए टुकड़ा और पीसीआर की शुरुआत के रूप में बुनियादी तकनीक में आण्विक जीव विज्ञान ( 5,6 ) .
In Mullis's original PCR process(5,6,8), the enzyme was used in vitro (in a controlled environment outside an organism). Mullis मूल की प्रक्रिया में पीसीआर ( 5,6,8 ) , एंजाइम विट्रो में प्रयोग किया जाता था ( एक नियंत्रित माहौल में बाहर एक जीव ) . The double-stranded DNA was separated into two single strands by heating it to 96°C. इस दोहरी असहाय डीएनए को दो अलग था एकल शोथित द्वारा गर्म करने के लिए यह 96 ° C. At this temperature, however, the E.Coli DNA polymerase was destroyed so that the enzyme had to be replenished after the heating stage of each cycle. इस तापमान तथापि , ई. के डीएनए कोलि पोलीमरेज़ नष्ट हो गया था ताकि एंजाइम को गर्म करने की हड्डियों के बाद चक्र के प्रत्येक चरण में है . Mullis's original PCR process was very inefficient since it required a great deal of time, vast amounts of DNA-Polymerase, and continual attention throughout the PCR process. Mullis के मूल पीसीआर के बाद से यह प्रक्रिया बहुत ही आवश्यक है अक्षम काफी समय के विशाल मात्रा में डीएनए पोलीमरेज़ , और नित्य ध्यान पूरे पीसीआर प्रक्रिया है .
Examination of the PCR amplification mechanism reveal its simplicity but also its elegance (Figure 2). Oligonucleotide primers are first designed to be complementary to the ends of the sequence to be amplified, and then mixed in molar excess with the DNA template and deoxyribonucleotides in an appropriate buffer. Following heating to denature the original strands and cooling to promote primer annealing, the oligonucleotides each bind to a different strand of the target fragment. The primers are positioned so that when each is extended by the action of a DNA polymerase, the newly synthesized strands will overlap the binding site of the opposite oligonucleotide. As the process of denaturation, annealing, and polymerase extension is continued the primers repeatedly bind to both the original DNA template and complementary sites in the newly synthesized strands and are extended to produce new copies of DNA (Figure 3). The end result is an exponential increase in the total number of DNA fragments that include the sequences between the PCR primers, which are finally represented at a theoretical abundance of 2n, where n is the number of cycles (1,7,13). परीक्षा की व्यवस्था प्रवर्धन पीसीआर से पता चलता है , लेकिन उसकी सरलता भी अपनी रमणीयता ( चित्रा 2 ) . Oligonucleotide प्राइमरों करने के लिए डिज़ाइन किए जा रहे हैं पहले के पूरक के सिरों के अनुक्रम को विभेद , और तब से अधिक के साथ मिश्रित molar में डीएनए और deoxyribonucleotides खाके में बफर उपयुक्त है . को गर्म करने के बाद मूल प्रकृति या मूलतत् व बदल देना शोथित और शीतलन को बढ़ावा देने के लिए प्रथम annealing , oligonucleotides प्रत्येक एक अलग करने के लिए बाध्य किनारा के लक्ष्य टुकड़ा है . प्राइमरों हैं ताकि स्थिति है , जब हर एक के विस्तार के द्वारा की गई कार्रवाई के डीएनए पोलीमरेज़ , नव संश्लेषित शोथित के बाध्यकारी होगा अतिव्याप्ति oligonucleotide साइट के विपरीत है . विकृतीकरण की प्रक्रिया के रूप में , annealing , और पोलीमरेज़ प्राइमरों के विस्तार को जारी रखा है बाध्य करने के लिए बार बार दोनों के मूल डीएनए टेम्पलेट और पूरक साइटों में नए संश्लेषित शोथित हैं और विस्तार के उत्पादन के लिए नए प्रतियां के डीएनए ( चित्रा 3 ) . अंतिम परिणाम है घातीय की कुल संख्या में वृद्धि की है कि डीएनए टुकड़ों में शामिल हैं पीसीआर प्राइमरों के दृश्यों के बीच है , जो अंततः का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं पर सैद्धांतिक 2n की बहुतायत है , जहाँ n है चक्र की संख्या ( 1 , 7,13 ) .
A DNA polymerase is a naturally occurring enzyme, a biological macromolecule that catalyzes the formation and repair of DNA. स्वाभाविक रूप से एक डीएनए पोलीमरेज़ होने एंजाइम है , एक जैविक macromolecule कि catalyzes के निर्माण और मरम्मत के डीएनए . It works by binding to a single DNA strand and creating a complementary strand. यह बाध्यकारी करने के लिए एक ही कार्य करती है और डीएनए किनारा किनारा बनाने के पूरक हैं . The accurate replication of all living matter depends on this activity, where it functions to duplicate DNA when cells divide (10,11). Only recently have scientists learned to manipulate this activity and apply it to scientific research. The earliest PCR experiments utlilized the Klenow fragment of Escherichia coli DNA polymerase I at a temperature of 37C to amplify specific targets from human genomic DNA (5,6). Often these PCR reactions produced incompletely pure target product as judged by gel electrophoresis (1). These initial PCR amplifications with the Klenow fragment were not highly specific (5,6). Although a unique DNA fragment could be amplified ~200,000 fold from genomic DNA, only about 1% of the PCR product was the targeted sequence (13). A specific hybridization probe was required to analyse the amplified DNA (5,6). यह सही बात दोहराने के रहने वाले सभी इस गतिविधि पर निर्भर करता है , जहां यह कार्य करने के लिए डीएनए डुप्लिकेट कोशिकाओं के विभाजन के समय ( 10,11 ) . केवल सीखा वैज्ञानिकों ने हाल ही में हेरफेर करने के लिए इस गतिविधि और इसे लागू करने के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान . utlilized के प्रयोगों की जल्द से जल्द पीसीआर Klenow टुकड़ा इस्चेरिचिया कोली के डीएनए पोलीमरेज़ मैं 37C के तापमान में एक विशिष्ट लक्ष्य से मानव को amplify जीनोमिक डीएनए ( 5,6 ) . पीसीआर अक्सर इन प्रतिक्रियाओं का उत्पादन लक्ष्य incompletely शुद्ध उत्पाद के रूप में न्याय के द्वारा जेल वैद्युतकणसंचलन ( 1 ) . amplifications के साथ ये शुरुआती पीसीआर Klenow टुकड़ा नहीं थे अति विशिष्ट ( 5,6 ) . यद्यपि एक अद्वितीय डीएनए टुकड़ा किया जा सकता है विभेद ~ गुना 200000 जीनोमिक डीएनए से , केवल लगभग 1 % पीसीआर के उत्पाद था लक्षित अनुक्रम ( 13 ) . संकरण एक विशिष्ट जांच के लिए आवश्यक था डीएनए विश्लेषण के विभेद ( 5,6 ) .
Some PCR conditions were determined to increase the stringency of primer hybridization such as lower MgCl2 concentrations and higher annealing temperatures. कुछ शर्तों के पीसीआर बढ़ाने के लिए निर्धारित किए गए तंगी के प्रथम संकरण जैसे कम सांद्रता MgCl2 और उच्च तापमान annealing .
Furthermore, the concentration of enzyme and primers, the annealing time, extension time, and number of PCR cycles all were found to effect the specificity of the PCR. इसके अलावा , एंजाइम की एकाग्रता और प्राइमरों , annealing समय , समय विस्तार है , और पीसीआर संख्या में पाए गए सभी चक्रों के प्रभाव को पीसीआर की विशिष्टता है .
Also, the concentration of a specific sequence in a sample can also influence the relative homogeneity of the PCR products (1,7,13,14,15). Deoxyribonucleotide triphosphates and magnesium in an appropriate buffer are also important ingredients for PCR. The efficiency and specificity of PCRs can be affected by variations in the concentration and ratio of free magnesium, deoxyribonucleotide triphosphates, and primers. इसके अलावा , इस अनुक्रम में एकाग्रता की एक विशिष्ट प्रभाव के एक नमूने के रिश्तेदार भी कर सकते हैं सजातीयता उत्पादों के पीसीआर ( 1,7,13,14,15 ) . Deoxyribonucleotide triphosphates और मैग्नीशियम में एक उपयुक्त हैं बफर पीसीआर के लिए भी महत्वपूर्ण तत्व है . दक्षता और विशिष्टता के PCRs से प्रभावित किया जा सकता है विविधताओं के अनुपात में एकाग्रता और मुक्त मैग्नीशियम , deoxyribonucleotide triphosphates , और प्राइमरों . These reagents must be optimized in order to achieve high specificity and yield (14). It was also discovered that the effect of temperature and oligonucleotide primer length on the specificity and efficiency of amplification by the polymerase chain reaction (15). ये अभिकर्मकों होना चाहिए अनुकूलित में विशिष्टता प्राप्त करने के लिए और अधिक उपज ( 14 ) . यह भी पता चला कि तापमान के प्रभाव का प्रथम और oligonucleotide लंबाई पर विशिष्टता और कुशलता के प्रवर्धन द्वारा पोलीमरेज़ चेन प्रतिक्रिया ( 15 ) .
The inactivation of the Klenow fragment of Escherichia coli DNA polymerase I at the high temperature required for strand separation required the addition of enzyme after the denaturation step of each cycle (5,6). Prior to 1988, anyone conducting a PCR reaction procedure was obliged to sit patiently by a series of water baths or heating blocks and add a fresh aliquot of E.Coli DNA polymerase after each denaturation step, which was typically carried out by immersing the reaction vessel in boiling water for ½ a minute to 3 minutes (7). This rather tedious step was eliminated by the introduction of a thermostable DNA polymerase, the Taq DNA polymerase (12) once, at the beginning of the PCR reaction. The thermostable properties of the DNA polymerase activity were isolated from Thermus aquaticus (Taq) (Figure 4) that grow in geysers of over 110C, and have contributed greatly to the yield, specificity, automation, and utility of the polymerase chain reaction (1,7,12). The Taq enzyme can withstand repeated heating to 94C and so each time the mixture is cooled to allow the oligonucleotide primers to bind the catalyst for the extension is already present (1,7). However, higher annealing temperatures were not established until the single “most important development of PCR development” (8), the purification and commercial distribution of a heat-resistant DNA polymerase from the thermophilic bacterium Thermus aquaticus ( Taq ) (12). इस inactivation का टुकड़ा Klenow इस्चेरिचिया कोली के डीएनए पोलीमरेज़ मैं उच्च तापमान पर किनारा अलग करने के लिए आवश्यक एंजाइम को जोड़ने की आवश्यकता होने के बाद प्रत्येक कदम विकृतीकरण चक्र ( 5,6 ) . 1988 से पहले , किसी एक का आयोजन किया गया था पीसीआर प्रतिक्रिया प्रक्रिया उपकृत धैर्यपूर्वक बैठने की एक श्रृंखला के द्वारा पानी गर्म करने या स्नान ब्लॉक और नए सिरे से जोड़ने के अशेष भाजक ई. कोलि पोलीमरेज़ डीएनए के बाद प्रत्येक विकृतीकरण कदम है , जो आमतौर द्वारा किया गया था आपनी पोत की प्रतिक्रिया के लिए गर्म पानी में आधा एक मिनट से 3 मिनट तक ( 7 ) . थकाऊ बल्कि इस कदम की शुरुआत के द्वारा समाप्त किया गया था thermostable एक डीएनए पोलीमरेज़ , Taq डीएनए पोलीमरेज़ ( 12 ) एक बार की शुरुआत में पीसीआर की प्रतिक्रिया . thermostable गुणों के डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि से अलग थे Thermus aquaticus ( Taq ) ( चित्रा 4 ) में geysers से अधिक की वृद्धि है कि 110C , और उपज के लिए बहुत योगदान दिया है , विशिष्टता , स्वचालन , और उपयोगिता के पोलीमरेज़ चेन प्रतिक्रिया ( 1,7,12 ) . Taq एंजाइम सकता है और बार बार गर्म करने के लिए इतनी 94C हर बार की मिश्रण है ठंडे की अनुमति देने के लिए बाध्य करने की oligonucleotide प्राइमरों के उत्प्रेरक के विस्तार के लिए पहले से ही मौजूद है ( 1,7 ) . हालांकि , उच्च तापमान annealing तक स्थापित नहीं थे एकल " सबसे महत्वपूर्ण विकास के विकास पीसीआर " ( 8 ) , शुद्धीकरण के वितरण की गर्मी और वाणिज्यिक प्रतिरोधी पोलीमरेज़ डीएनए से thermophilic जीवाणु Thermus aquaticus ( Taq ) ( 12 ) .
The isolation of a heat-resistant DNA polymerase also allowed primer annealing and extension to be carried out at elevated temperatures (1,7,12,13), thereby reducing mismatched annealing to nontarget sequences (non-specific amplification) or increasing specificity. In this way, for many amplifications the PCR product could be detected as a single ethidium bromide-stained band on an electrophoretic gel (12). This increased specificity also increased DNA yield of the target sequence. Moreover, longer PCR products could be amplified from genomic DNA, probably due to a reduction in the secondary structure of the template strands at the elevated temperature used for primer extension. The upper size limit for Klenow fragment polymerase amplification was only about 400bp. Taq polymerase and other thermostable polymerases have synthesized fragments up to 10 kb (1,7,12,13). The availability of Taq polymerase has also greatly simplified the automation of the reaction as it is a much easier task to construct an apparatus that will cycle a reaction tube through different temperatures than to manufacture a device that would perform both the thermocycling and the addition of enzyme aliquots. Currently there is a great variety of thermocyclers available commercially. This development has been a significant factor in the rapid application of this technology by the scientific community (7). इस अलगाव की गर्मी प्रतिरोधी पोलीमरेज़ डीएनए की अनुमति भी प्रथम annealing और विस्तार से बाहर ले जाने पर ऊँचा तापमान ( 1,7,12,13 ) , अनमेल annealing कम करने के लिए दृश्य nontarget ( गैर विशिष्ट प्रवर्धन ) या विशिष्टता बढ़ रही है . इस तरह के लिए कई पीसीआर amplifications के उत्पाद के रूप में एक भी पता लगाया जा सकता है ethidium ब्रोमाइड - कलंकित बैंड पर electrophoretic जेल ( 12 ) . वृद्धि की विशिष्टता यह भी बढ़ डीएनए अनुक्रम उपज का लक्ष्य है . इसके अलावा , अब उत्पादों पीसीआर से विभेद किया जा सकता है जीनोमिक डीएनए , संभवतः में कमी के कारण माध्यमिक संरचना के खाके में ऊँचा शोथित तापमान प्रथम विस्तार के लिए इस्तेमाल किया है . Klenow के लिए आकार सीमा के ऊपरी टुकड़ा पोलीमरेज़ प्रवर्धन 400bp के बारे में ही किया गया था . Taq पोलीमरेज़ और अन्य thermostable polymerases ने संश्लेषित टुकड़ों से 10 तक केबी ( 1,7,12,13 ) . की उपलब्धता Taq पोलीमरेज़ ने भी बहुत सरल के स्वचालन की प्रतिक्रिया के रूप में यह एक आसान काम करने के लिए एक उपकरण का निर्माण होगा कि एक चक्र प्रतिक्रिया ट्यूब के माध्यम से विभिन्न तापमान की तुलना में विनिर्माण के लिए एक उपकरण प्रदर्शन होगा कि दोनों के अलावा और thermocycling एंजाइम aliquots . वर्तमान में विभिन्न प्रकार के एक महान है thermocyclers व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है . विकास किया गया है यह एक महत्वपूर्ण कारक में तेजी से इस प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग के द्वारा वैज्ञानिक समुदाय ( 7 ) .
In addition to the production of double-stranded, blunt-ended DNA fragments which may be formed by PCR, two other features of the PCR scheme contribute greatly to the utility of PCR. First, the position of binding of the primers defines the boundaries of the amplified fragment and therefore the prior molecular cloning requirement of restriction endonuclease recognition sites is not required for PCR. As only a limited number of DNA sequences are restriction sites, PCR greatly increases the flexibility of choice of fragment size and composition. Secondly, it is not necessary for PCR oligonucleotides to be exactly complementary to the template DNA. “Tails” may be added to the 5’ end of the primer to introduce sequences within the priming sites which thus may be exploited to introduce restriction endonuclease recognition sites or other useful sequences such as mutations into the amplified DNA. This phenomena allowed the emergence of PCR as a method for rapid DNA cloning (1,7,13). इसके अतिरिक्त उत्पादन के लिए डबल असहाय , मुँहफट डीएनए के टुकड़ों को समाप्त किया जा सकता है जिसके द्वारा बनाई पीसीआर , दो अन्य सुविधाओं के लिए बहुत योगदान पीसीआर योजना की उपयोगिता के पीसीआर . सबसे पहले की स्थिति के बंधन को परिभाषित प्राइमरों की सीमाओं में टुकड़ा है और इसलिए विभेद के पहले आणविक क्लोनिंग की आवश्यकता को मान्यता प्रतिबंध endonuclease साइटों के लिए पीसीआर की आवश्यकता नहीं है . रूप में केवल एक सीमित संख्या में डीएनए प्रतिबंध साइटों के दृश्य हैं , बहुत बढ़ जाती है पीसीआर के लचीलेपन का टुकड़ा पसंद के आकार और संरचना है . दूसरे , यह है पीसीआर के लिए आवश्यक नहीं oligonucleotides को ठीक करने के लिए अनुपूरक टेम्पलेट डीएनए . " पूंछ " 5 में जोड़ा जा सकता है ' के अंत में प्रथम शुरू करने के भीतर दृश्य priming साइटों का शोषण किया जा सकता है जो इस प्रकार लागू करने या अन्य साइटों पर प्रतिबंध endonuclease मान्यता उपयोगी दृश्य ऐसे में म्यूटेशन के रूप में विभेद डीएनए . इस घटना की अनुमति के उद्भव पीसीआर विधि के रूप में तेजी से डीएनए के लिए क्लोनिंग ( 1,7,13 ) .
Molecular cloning has benefited from the emergence of PCR as a technique. Direct cloning was first conducted using a 110 bp DNA fragment amplified by PCR and oligonucleotide primers which contained restriction endonuclease recognition sites added to their 5’ ends. These sites were used to facilitate cloning of the amplified DNA into an M13 plasmid (17). The 110 bp fragment was also sequenced to confirm that this approach was a rapid yet reliable approach to cloning. (Figure 5) आण्विक ने क्लोनिंग के उद्भव पीसीआर से लाभ के रूप में एक तकनीक है . प्रत्यक्ष क्लोनिंग का उपयोग करते हुए पहली बार आयोजित एक टुकड़ा विभेद द्वारा डीएनए 110 बीपी और पीसीआर oligonucleotide प्राइमरों जिसमें कहा प्रतिबंध endonuclease मान्यता साइटों को उनके 5 ' समाप्त हो जाती है . को सुविधाजनक बनाने के लिए इन साइटों का उपयोग किया गया क्लोनिंग विभेद के डीएनए को एक M13 प्लाज्मिड ( 17 ) . की 110 बीपी टुकड़ा भी अनुक्रम निर्धारण किया गया है कि इस दृष्टिकोण की पुष्टि करने के लिए एक विश्वसनीय तेजी से अभी तक दृष्टिकोण क्लोनिंग . ( चित्रा 5 )
Cell-based DNA cloning involves DNA replication in vivo, which is associated with a very high fidelity of copying because of proofreading mechanisms. However, when DNA is replicated in vitro as with PCR, the copying error rate is considerably greater. The most widely used polymerase, Taq DNA polymerase however, has no associated 3’to 5’ exonuclease to confer a proofreading function. Thus the error rate due to base misincorporation during DNA replication is rather high for Taq : for a 1 kb sequence that has undergone 20 effective cycles of duplication, approximately 40% of the new DNA strands synthesized by PCR using this enzyme will contain an incorrect nucleotide resulting from a copying error (16). सेल डीएनए आधारित डीएनए दोहराने में vivo क्लोनिंग शामिल है , जो बहुत अधिक निष्ठा के साथ जुड़ा की नकल के कारण proofreading व्यवस्था है . लेकिन , जब विट्रो के रूप में &#
