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Automated Edman Degradation स्वचालित Edman पतन

Amino Acid Sequences can be determined by Automated Edman Degradation एमिनो एसिड द्वारा निर्धारित किया जा सकता है स्वचालित दृश्य Edman पतन

The amino acid composition of the peptide is determined.  The peptide is hydrolyzed into its constituent amino acid by heating it in 6 N HCl at 110°C for 24 hours.  Stanford Moore and William Stein showed that amino acids in hydrolysates can be separated by ionexchange chromatography on columns of sulfonated polystyrene and quantitated by reacting them with ninhydrin. एमिनो एसिड की संरचना के पेप्टाइड निर्धारित की जाती है . पेप्टाइड है hydrolyzed को अपने घटक अमीनो अम्ल के द्वारा यह गर्म करने में 6 N एचसीएल 110 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए है . स्टैनफोर्ड मूर तथा विलियम Stein से पता चला है कि अमीनो एसिड में hydrolysates द्वारा अलग किया जा सकता है ionexchange क्रोमैटोग्राफी पर कॉलम sulfonated पॉलीस्टीरीन के द्वारा प्रतिक्रिया quantitated और उन के साथ ninhydrin .

Amino acids treated this way give an intense blue color, except for praline, which gives a yellow color because it contains a secondary amino group.  The concentration of amino acid in a solution is proportional to the optical absorbance of the solution after heating it with ninhydrin.  This technique can detect a microgram (10nmol) of an amino acid, which is about the amount present in a thumbprint. अमीनो एसिड का उपचार इस तरह का एक गहन नीले रंग दे , सिवाय प्रेलाइन के लिए , जो एक पीले रंग देता है क्योंकि इसमें एक उच्च माध्यमिक अमीनो समूह है . की एकाग्रता के एमिनो एसिड में एक समाधान है आनुपातिक के लिए ऑप्टिकल absorbance के समाधान के बाद यह गर्म करने के साथ ninhydrin . इस तकनीक का पता लगा सकता है microgram ( 10nmol ) के एक अमीनो एसिड से होता है , जो राशि के बारे में वर्तमान में एक thumbprint .

As little as a nanogram (10 pmol) of an amino acid can be detected by means of fluorescamine, which reacts with the a-amino group of a highly fluorescent product.  The identity of the amino acid is revealed by its elution volume, which in the volume of buffer used to remove the amino acid from the column. जैसा कि बहुत कम nanogram के रूप में ( 10 pmol ) अमीनो एसिड के एक साधन के द्वारा पाया जा सकता है fluorescamine है , जो प्रतिक्रिया के साथ एक अमीनो - उत्पाद समूह के एक उच्च फ्लोरोसेंट . की पहचान के द्वारा पता चला है एमिनो एसिड की मात्रा अपने क्षालन है , जो में बफर की मात्रा को हटाने के लिए प्रयोग किया जाता अमीनो एसिड से स्तम्भ है .

The amino-terminal residue of a protein or peptide can be identified by labeling it with a compound that forms a stable covalent link. इस अमीनो टर्मिनल के एक प्रोटीन के अवशेषों से पहचाना जा सकता है या पेप्टाइड द्वारा लेबल के साथ मिश्रित है कि यह एक प्रकार स्थिर covalent कड़ी है .

Fluorodinitrobenzene (FDNB) was first used for this purpose by Frederick Sanger.  Dabsyl chloride is now commonly used because it forms intensely colored derivatives that can be detected with high sensitivity.  It reacts with an uncharged a-NH2 group to form a sulfonamide derivative that is stable under conditions that hydrolyze peptide bonds. Fluorodinitrobenzene ( FDNB ) का इस्तेमाल किया गया था फ्रेडरिक द्वारा इस प्रयोजन के लिए Sanger . Dabsyl क्लोराइड अब सामान्यतः प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह अत्यंत रूपों रंगीन व्युत्पत्तियों है कि उच्च संवेदनशीलता के साथ पकड़ा जा सकता है . प्रतिक्रिया के साथ यह एक uncharged - NH2 एक समूह के रूप में sulfonamide है कि व्युत्पन्न स्थिर है कि शर्तों के तहत hydrolyze पेप्टाइड बांड .

Although the dabsyl method for determining the amino-terminal residue is sensitive and powerful, it cannot be used repeatedly on the same peptide because the peptide is totally degraded in the acid-hydrolysis step.  Pehr Edman devised a method for labeling the amino-terminal residue and cleaving it from the peptide without disrupting the peptide bonds between the other amino acid residues.  The Edman degradation sequentially removes one residue at a time from the amino end of a peptide.  Phenyl isothiocyanate reacts with the uncharged terminal amino group of the peptide to form a phenylthiocarbamoyl derivative.  Then, under mildy acidic conditions, a cyclic derivative of the terminal amino acid is liberated, which leaves an intact peptide shortened by one amino acid. यद्यपि dabsyl पद्धति के लिए निर्धारित करने के अमीनो टर्मिनल के अवशेषों के प्रति संवेदनशील है और शक्तिशाली , यह प्रयोग नहीं किया जा सकता पर बार बार एक ही पेप्टाइड पेप्टाइड है क्योंकि पूरी तरह से अवक्रमित में एसिड की hydrolysis कदम है . Pehr Edman लेबलिंग के लिए तैयार की एक विधि अमीनो टर्मिनल के अवशेषों और यह cleaving से पेप्टाइड के बिना बाधा पहुँचा पेप्टाइड बांड के बीच अन्य एमिनो एसिड अवशेष है . Edman के पतन को हटा sequentially अवशिष्ट एक समय में एक से अंत तक एक अमीनो पेप्टाइड . फिनायल आइसोथियोसाइनेट प्रतिक्रिया के साथ uncharged अमीनो टर्मिनल के समूह के रूप में पेप्टाइड एक phenylthiocarbamoyl व्युत्पन्न है . तब , mildy अम्लीय शर्तों के तहत , एक चक्रीय व्युत्पन्न टर्मिनल के एमिनो एसिड मुक्त है , जो पत्तियों का एक अक्षुण्ण एमिनो एसिड पेप्टाइड एक छोटा है .

Analyses of protein structures have been markedly accelerated by the development of sequenators, which are automated instruments for the determination of amino acid sequence.  In a liquid-phase sequenator, a thin film of protein in a spinning cylindrical cup is subjected to the Edman degradation.  The reagents and extracting solvents are passed over the immobilized film of protein, and the released PTH-amino acid is identified by high-pressure liquid chromatography (also called high-performance liquid chromatography, HPLC). प्रोटीन का विश्लेषण किया गया है ढांचों के विकास के द्वारा हुआ त्वरित sequenators , जो स्वचालित उपकरणों के लिए दृढ़ संकल्प के अमीनो एसिड अनुक्रम . चरणों में एक तरल sequenator , एक पतली फिल्म में एक प्रोटीन की कताई बेलनाकार कप Edman पतन के आधीन है . इस रिएजेंटो और निकालने के पारित विलायकों हैं immobilized फिल्म के प्रोटीन , और एमिनो एसिड की PTH जारी की पहचान की है तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा उच्च दबाव ( उच्च प्रदर्शन भी कहा जाता है तरल क्रोमैटोग्राफी , HPLC ) .

One cycle of the Edman degradation is carried out in less than two hours.  By repeated degradations, the amino acid sequence of some fifty residues in a protein can be determined.  Gas-phase sequenators can analyze picomole quantities of peptides and proteins.  This high sensitivity makes it feasible to analyze the sequence of a protein sample eluted from a single band of an SDS-polyacrylamide gel. एक चक्र के पतन है Edman में किए गए दो घंटे से भी कम है . degradations को दोहराया , अमीनो एसिड अनुक्रम पचास के कुछ अवशेष में एक प्रोटीन से निर्धारित किया जा सकता है . गैस sequenators चरण का विश्लेषण कर सकते हैं और पेप्टाइड्स picomole मात्रा में प्रोटीन है . उच्च यह संवेदनशीलता संभव बनाता है विश्लेषण करने के लिए प्रोटीन के अनुक्रम में एक नमूना eluted से एक बैंड के एक जेल SDS - polyacrylamide .