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Learn about cDNA cloning. सीडीएनए क्लोनिंग के बारे में जानें .
A cDNA (short for complemantary DNA or copy DNA) is a DNA copy of an RNA, usually an mRNA. एक सीडीएनए ( छोटे से कॉपी या डीएनए के लिए डीएनए complemantary ) एक डीएनए के प्रति एक शाही सेना , आमतौर पर एक mRNA . Sometimes we want to make a cDNA library, a set of clones reprensenting as many as possible of the mRNAs in a given cell type at a given time. कई बार हम चाहते हैं कि सीडीएनए बनाने के लिए एक पुस्तकालय , reprensenting क्लोनों का एक समूह के रूप में अधिक से अधिक के mRNAs में किसी प्रकार की कोशिकाओं में एक बार दिया है . Such libraries can contain tens of thousands of different clones. इस तरह के हो सकते हैं पुस्तकालयों हजारों क्लोनों अलग है . Other times, we want to make one particular cDNA- aclone containing a DNA copy of just one mRNA. अन्य समय , हम करना चाहते हैं जिनमें से एक विशेष aclone सीडीएनए के एक डीएनए का सिर्फ एक कॉपी mRNA . This technique we use depends in part on which of these goals we wish to achieve. हम इस तकनीक का प्रयोग में भाग पर निर्भर करती है जो हम इन लक्ष्यों को प्राप्त करना चाहते हैं .
If we want to build a cDNA library, we can use a simple but effective strategy that relies on a process called nick translation. यदि हम चाहते हैं कि सीडीएनए में एक पुस्तकालय बनाने के लिए , हम एक सरल का उपयोग कर सकते हैं लेकिन प्रभावी रणनीति है कि एक प्रक्रिया पर भरोसा निक अनुवाद का आह्वान किया है . The essence of nick translation is the simultaneous removal of DNA ahead of a nick (a single-stranded DNA break) and synthesis of DNA behind the nick. निक अनुवाद का सारतत्व है हटाने के डीएनए के एक साथ आगे एक निक ( एक असहाय डीएनए तोड़ ) तथा संश्लेषण के डीएनए के पीछे निक . The net result is to move, or translate the nick in the 5'-3' direction. शुद्ध परिणाम को स्थानांतरित करने के लिए है , या अनुवाद के निक में 5' - 3 ' दिशा . The enzyme we usually use the nick translation is E.coli DNA polymerase I, which has a 5'-3' exonuclease activity that allows the enzyme to degrade DNA ahead of the nick as it moves along. आमतौर पर हम इस एंजाइम निक अनुवाद का उपयोग डीएनए पोलीमरेज़ मैं ई. है , जो है 5' - 3 ' exonuclease गतिविधि की अनुमति देता है कि एंजाइम को आगे degrade डीएनए के साथ निक के रूप में यह कदम है .
The central part any cDNA cloning procedure is synthesis of the cDNA from an mRNA template using reverse transcriptase. केन्द्रीय सीडीएनए क्लोनिंग प्रक्रिया के किसी भी भाग संश्लेषण के सीडीएनए mRNA खाके से एक का उपयोग कर रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस . Reverse transcriptase is like any other DNA-synthesizing enzyme is that it cannot initiate DNA synthesis without a primer. रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के समान है , किसी भी अन्य डीएनए synthesizing एंजाइम यह है कि यह नहीं कर सकते आरंभ डीएनए संश्लेषण के बिना प्रथम है . To get around this problem, we take advantage of the poly(A) tail at the 3'-end of most eukaryotic mRNAs and use oligo(dT) as the primer. इस समस्या के आसपास पाने के लिए , हम लाभ उठाने की पाली ( ए ) की पूँछ पर 3' के अंत में सबसे eukaryotic mRNAs और उपयोग oligo ( डीटी ) के रूप में प्रथम है . The oligo(dT) is complementary to poly(A), so it binds to the poly(A) at the 3'-end of the mRNA and primes DNA synthesis, using the mRNA as a template. इस oligo ( डीटी ) के पूरक है पाली ( ए ) , इसलिए इसे बांधे को पॉली ( ए ) के अंत में 3' के mRNA और primes डीएनए संश्लेषण , mRNA का प्रयोग कर उसे खाके के रूप में .
After the mRNA has been copied, yielding a single-stranded DNA (the "first strand"), we partially degrade the mRNA with ribonuclease H (RNase H). mRNA कॉपी के बाद किया गया है , एक असहाय उपज डीएनए ( " पहले किनारा " ) , हम mRNA आंशिक degrade के साथ ribonuclease एच ( RNase एच ) . This enzyme degrades the RNA strand of an RNA/DNA hybrid- just what we need to begin to digest the RNA from our first strand cDNA. यह degrades एंजाइम की शाही सेना का किनारा शाही सेना / डीएनए संकर ही करने लगते हैं कि हम क्या करने की आवश्यकता है डाइजेस्ट के शाही सेना से हमारी पहली किनारा सीडीएनए . The remaining RNA fragments serve as primers for making the "second strand," using the first as the template. शेष शाही सेना टुकड़ों के रूप में सेवा प्राइमरों बनाने के लिए " दूसरा किनारा , " टेम्पलेट का उपयोग करने के पहले के रूप में . This is the nick-translation phase of the process and again, E. coli DNA polymerase I is the enzyme we use to carry out the nick-translation reaction. यह चरण के निक के अनुवाद की प्रक्रिया में और फिर , ई. कोली डीएनए मैं पोलीमरेज़ है एंजाइम का उपयोग करने के लिए हमें बाहर ले जाने की प्रतिक्रिया निक के अनुवाद . The net result is a double-stranded cDNA with a small fragment of RNA at the 5'-end of the second strand. शुद्ध परिणाम है दोहरी असहाय सीडीएनए के साथ एक छोटा सा टुकड़ा की शाही सेना में 5' के अंत के दूसरे किनारा .
Our next task is to ligate the cDNA to a vector. हमारा काम यह है कि अगले ligate सीडीएनए के एक सदिश . This was easy with our pieces of genomic DNA cleaved with restriction enzymes, but cDNAs have no sticky ends. यह आसान के साथ हमारे टुकड़े जीनोमिक डीएनए के साथ cleaved एंजाइमों प्रतिबंध है , लेकिन cDNAs अवरुद्ध नहीं पूरी हो जाती है . We can ligate blunt ends together, even though that is a relatively inefficient process. हम कर सकते हैं ligate मुँहफट एक साथ समाप्त हो जाती है , हालांकि यह है कि अपेक्षाकृत अक्षम प्रक्रिया है . However, if we want the efficient ligation afforded by sticky ends, we can tack sticky ends (oligo[dC]) onto the cDNA, using an enzyme called terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) or simply terminal transferase and one of the deoxribonucleoside triphosphates. लेकिन , यदि हम चाहते हैं कि कुशल बांधना सकती द्वारा अवरुद्ध समाप्त हो जाती है , हम कर सकते हैं दिशा अवरुद्ध समाप्त हो जाती है ( oligo [ डीसी ] ) पर सीडीएनए की है , टर्मिनल के नाम का उपयोग करते हुए एक एंजाइम deoxynucleotidyl transferase ( TdT ) transferase और एक या बस टर्मिनल के deoxribonucleoside triphosphates . In the case, we use dCTP. के मामले में , हम dCTP का उपयोग करें . The enzyme adds dCMPs, one at a time, to the 3'-ends of the cDNA. एंजाइम की dCMPs कहते हैं , एक बार में एक है , को 3' के सिरों को सीडीएनए . In the same way, we attach oligo(dG) ends to our vector and allow the oligo (dC)s to anneal to the oligo(dG)s. में इसी तरह , हम संलग्न oligo ( डीजी ) को समाप्त हो जाती है और हमारे सदिश की अनुमति देने के oligo ( डीसी ) s को पानी देना को oligo ( डीजी ) s. This brings the vector and cDNA together in a recombinant DNA that can be used directly for transformation. यह , इस सदिश और रिकॉम्बीनेंट डीएनए सीडीएनए में एक साथ प्रयोग किया जा सकता है कि बदलाव के लिए सीधे है . The base pairing between the oligonucleotide tails is strong enough that no ligation is required before transformation. इस आधार pairing के बीच oligonucleotide पूंछ मजबूत है कि पर्याप्त नहीं बांधना से पहले परिवर्तन की आवश्यकता है . The DNA ligase inside the transformed cells finally performs the ligation. इस परिवर्तन की कोशिकाओं के डीएनए के अंदर ligase प्रदर्शन के अंत में बांधना है .
See the DNA Molecule in 3-Dimensions देखें डीएनए अणु में 3 आयाम
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