L'ACP a été inventé par Kary Mullis. Lorsqu'il a pensé vers le haut de l'ACP en 1983, Mullis fonctionnait dans Emeryville, la Californie pour Cetus Corporation, une des premières compagnies de biotechnologie. Là, il a été chargé de faire les chaînes courtes de l'ADN pour d'autres scientifiques. Mullis a écrit qu'il a conçu de l'ACP tout en croisant le long de l'omnibus 1 de Côte Pacifique une nuit dans sa voiture [2]. Il jouait dans son esprit avec une nouvelle voie d'analyser des changements (mutations) de l'ADN quand il s'est rendu compte qu'il avait à la place inventé une méthode d'amplifier n'importe quelle région d'ADN. Mullis a indiqué qu'avant que son voyage ait été terminé, il savoring déjà les perspectives d'un prix Nobel. Il a partagé le prix Nobel en chimie avec Michael Smith en 1993.
Comme Mullis a écrit dans l'Américain scientifique : « Commençant par une molécule simple de l'ADN de matériel génétique, l'ACP peut produire de 100 milliards de molécules semblables dans un après-midi. Il est facile exécuter la réaction. Elle n'exige pas plus qu'un tube à essai, quelques réactifs simples, et une source de chaleur. »
L'ACP est employé pour amplifier des régions spécifiques d'un brin d'ADN. Ceci peut être un gène simple, juste une partie d'un gène, ou un ordre de non-codage. La plupart des méthodes d'ACP amplifient typiquement des fragments d'ADN des paires de base de jusqu'à 10 kilos (kb). Quelques méthodes d'ACP peuvent copier des fragments d'ADN du kb jusqu'à 40 dans la taille [3], qui est toujours beaucoup moins que toute la teneur nucléaire en ADN d'une cellule eucaryotique - pour la comparaison, le génomehaploïde d'une cellule humaine se compose d'environ trois milliards de paires de base d'ADN (3 gigaoctets).
L'ACP, comme actuel pratiqué, exige plusieurs composants de base [4]. Ces composants sont :
Descripteur d'ADN qui contient la région du fragment d'ADN à amplifier
Un ou plusieurs amorces, qui sont complémentaires aux régions d'ADN au 5 ' et 3 ' fins de la région d'ADN qui doit être amplifiée (voient la section suivante sur des amorces)
Une polymérase de Taq (ou un ADN polymérase Différent avec un optimum de la température à environ 70°C), un ADN polymérase, Employé pour synthétiser une copie d'ADN de la région à amplifier
Solution tampon, qui fournit un environnement chimique approprié pour l'activité et la stabilité optimas de l'ADN polymérase
Ions bivalents decation, demagnésium ou de manganèse ; généralement Mg2+ est utilisé, mais Mn2+ peut être utilisé pour la mutagénèse ACP-négociée d'ADN, à mesure qu'une concentration plus élevée de Mn2+ augmente la cadence d'erreur pendant la synthèse d'ADN [5]
L'ACP est effectué dans de petits tubes de réaction (volumes de 0.2-0.5 ml), contenant un volume de réaction typique de ¼ l de 15-100 Î, qui sont insérés dans un cycler thermique. C'est une machine qui chauffe et refroidit les tubes de réaction dans lui à la température précise exigée pour chaque étape de la réaction. La plupart des cyclers thermiques ont chauffé des couvercles pour empêcher la condensation sur l'intérieur des chapeaux de tube de réaction. Alternativement, une couche d'huile peut être placée sur le mélange de la réaction pour empêcher l'évaporation. Ces machines ont coûté plus de $2.500 USD, à partir de 2004.
Amorces
Pour ACP-amplifier sélectivement un fragment d'ADN, des amorces appropriées doivent être conçues et synthétisées. Les amorces sont les oligonucléotides courts, c.-à-d., fragments chimiquement synthétisés et monocatenaires d'ADN - souvent pas plus de 50 et habituellement seulement 18 à 25 paires de base longs - contenant les nucléotides qui sont complémentaires aux nucléotides aux deux extrémités du fragment d'ADN à amplifier. Ces bases complémentaires dans l'amorce et le descripteur d'ADN facilitent le recuit de l'amorce au descripteur d'ADN auquel l'ADN polymérase Peut lier et commencer par la synthèse d'un nouveau brin d'ADN qui est complémentaire au descripteur d'ADN (comme décrit ci-dessous).
La longueur des amorces et leur température de fonte désirée (TM) dépendent d'un certain nombre de considérations. Le TM d'une amorce -- ne pas être confondu avec le TM de l'ADN de descripteur -- est défini comme température à laquelle la moitié des accepteurs d'amorce au descripteur d'ADN sont occupées. À mesure que le TM augmente avec la longueur de l'amorce (fournie le contenu de la guanine (G) et de à l'adénine relative de la cytosine (c) (a) et des résidus de base du thymine (t) demeure constant), les amorces qui sont courtes (paires <15 de base) exigent une plus basse température de recuit (<50°C) pour l'amplification efficace. En raison de la composition de base en soi moins complexe des amorces courtes, ceux-ci peuvent potentiellement recuire à plusieurs positions sur un descripteur d'ADN, qui aurait comme conséquence l'amplification non spécifique indésirable. D'une part, utilisant une amorce qui est très longue (paires >40 de base) exige les températures de recuit qui sont au-dessus de 80°C, c.-à-d., aux températures qui empiètent sur l'activité et la stabilité de l'ADN polymérase. La longueur optima d'une amorce (avec une teneur en G+C de 40-60%) est généralement de 15 à 40 nucléotides avec une température de recuit entre 50°C et 74°C.
Quelques applications d'ACP exigent l'utilisation des amorces dégénérées, qui sont des mélanges des amorces ayant un ou plusieurs différences dans les bases aux positions spécifiques. L'utilisation des amorces dégénérées est nécessitée dans des exemples où l'ordre exact d'un descripteur d'ADN est inconnu, ou l'amplification des fragments d'ADN avec l'ordre légèrement différent est désirée. Par exemple, ils peuvent être exigés si un gène homologue (c.-à-d., un gène avec la fonction semblable, mais l'ordre différent d'ADN) doit être amplifié de différentes organizations. Un autre d'usage courant pour les amorces dégénérées est exigé quand la conception d'amorce peut seulement être exécutée sur l'ordre de protéine. Pendant que plusieurs différents codons de nucléotide peuvent coder pour un acide aminé (voir la dégénérescence du code génétique aucode génétique), la plupart des ordres de protéine peuvent être encodés par plusieurs différents ordres d'ADN. Un ordre d'amorce correspondant au codon pour l'isoleucine d'acide aminé peut être « ATH », où A représente l'adénine, le T pour le thymine, et le H pour l'adénine, le thymine, ou la cytosine. L'utilisation des amorces dégénérées peut considérablement réduire la spécificité de l'amplification d'ACP. Ce problème peut être en partie surmonté en utilisant l'ACP d'atterrissage.
Les considérations mentionnées ci-dessus font l'amorce concevoir un processus multipas pour assurer le bons rendement et qualité du produit d'ACP :
Le Chromatographie-contenu devrait être entre 40-60% ; idéalement il devrait y a une distribution égale de G+C et d'A+T le long de l'amorce.
Le TM calculé pour les deux amorces utilisées dans la réaction ne devrait pas différer >5°C.
La température idéale de recuit est habituellement 5°C au-dessous de l'amorce calculée TM. Cependant, elle devrait être choisie empiriquement pour différentes conditions.
Des épingles à cheveux individu-complémentaires intérieures de >4 et des dimères >8 devraient être évitées avec de longues séries (>4) de résidus de G ou de C.
Extrémité des 3 de l'amorce 3 la la ' conception de terminus est critique au succès d'ACP puisque le brin naissant d'ADN s'étend ' de l'amorce. Extrémité de l'amorce 3 la ' ne devrait pas contenir plus de 3-4 bases qui sont complémentaires à n'importe quelle région dans elle-même ou l'autre amorce utilisée dans la réaction et doit correctement apparier les bases dans le descripteur.
Il est souvent préférable d'avoir un nucléotide de G ou de C aux 3 ' terminus finaux de l'amorce (« bride de CHROMATOGRAPHIE GAZEUSE »), comme ceci améliore l'élongation efficace de brin dans l'ACP ; cependant ayant plus de trois résidus de G ou de C dans les cinq bases terminales la ' extrémité aux 3 devrait être évitée.
Tandis qu'il est très utile de suivre ces directives, dans la pratique, il est souvent impossible de concevoir les amorces qui remplissent tous les critères ci-dessus. En raison du nombre élevé de variables qui peuvent affecter l'ACP, même les amorces suboptimal conçues peuvent fonctionner bien, ainsi il est généralement recommandé de déterminer des conditions optimas empiriquement, par exemple, en utilisant différentes combinaisons d'amorce ou en changeant des états choisis d'ACP. Il y a des programmes informatiques qui peuvent aider à concevoir des amorces (voir les liens externes), mais l'appel final peut souvent seulement être fait après des épreuves expérimentales.
Procédé général d'ACP
L'ACP se compose habituellement d'une série de 20 à 35 cycles. Le plus généralement, l'ACP est effectué dans trois étapes (fig. 2), souvent précédée par une prise de la température au début et suivie d'une prise à l'extrémité.
Avant le premier cycle, pendant une étape d'initialisation, la réaction d'ACP est souvent chauffée à une température de 94-96°C (ou de 98°C si des polymérases extrêmement thermostables sont utilisées), et cette température est alors tenue pendant 1-9 minutes. Cette première prise est utilisée pour s'assurer que la majeure partie du descripteur d'ADN et des amorces sont dénaturées, c.-à-d., que l'ADN est fondu en perturbant les liaisons hydrogène entre les bases complémentaires dans deux brins d'ADN. En outre, quelques polymérases d'ACP exigent cette étape pour le lancement (voyez chaud-démarrent l'ACP). Après cette prise, le recyclage commence, par une étape à 94-98°C pendant 20-30 secondes (étape de dénaturation).
La dénaturation est suivie de l'étape de recuit. Dans cette étape la température de réaction est abaissée de sorte que les amorces puissent attacher au descripteur monocatenaire d'ADN. La température à cette étape dépend du TM des amorces (voir ci-dessus), et est habituellement entre 50-64°C pendant 20-40 secondes.
L'étape de recuit est suivie d'une étape d'extension/élongation pendant laquelle l'ADN polymérase Copie le descripteur d'ADN, commençant aux amorces recuites à tous les deux ses brins. La température à cette étape dépend de l'ADN polymérase Utilisé. La polymérase de Taq a un optimum de la température de 70-74°C ; ainsi, dans la plupart des cas, pendant l'extension une température de 72°C est utilisée. Le temps d'extension dépend de l'ADN polymérase Utilisé et de la longueur du fragment d'ADN à amplifier. Car un principe de base pratique, à sa température optimale, l'ADN polymérase Polymérisera mille bases en une minute. Une étape finale d'élongation est fréquemment employée après le dernier cycle pour s'assurer que toute ADN monocatenaire restante est complètement copiée. Ceci diffère des autres étapes d'élongation seulement parce qu'il est plus long--en général 10-15 minutes. Une prise finale de 4-15°C pendant un temps indéfini est souvent utilisée pour permettre l'entreposage à court terme de la réaction, particulièrement si des réactions sont exécutées durant la nuit, et ne peut pas être retirée juste après le recyclage.
Le schéma 2 : Schéma schématique du cycle d'ACP. (1) dénaturant au recuit de 94-96°C. (2) (par exemple) à l'élongation de 68°C. (3) à 72°C (P=Polymerase). (4) le premier cycle est complet. Les deux brins en résultant d'ADN composent l'ADN de descripteur pour le prochain cycle, de ce fait doublant la quantité d'ADN à chaque nouveau cycle (un total de trois cycles est affichés ci-dessus).
Protocole d'ACP d'exemple
Les temps et les températures indiqués dans cet exemple sont pris d'un programme d'ACP qui a été avec succès utilisé sur un fragment de 250 points d'ébullition des C-terminus du insuline-comme ledescripteur dufacteur de croissance (IGF) : Fait.
Image d'électrophorèse de gel d'un ACP standard. Deux ensembles d'amorces spécifiques ont été utilisés pour amplifier un gène de trois tissus séparés. Pendant que le gel affiche, le tissu #1 manque de ce gène, tandis que le tissu #2 et #3 possèdent ce gène.
Le mélange de la réaction se compose
1.0 Descripteur d'ADN d'µl (100 ng/µl)
2.5 µl d'amorce, µl 1.25 par amorce (100 ng/µl)
1.0 Pfu-Polymérase d'µl
1.0 Nucléotides d'µl
5.0 Solution tampon d'µl
89.5 L'eau d'µl
Un tube de réaction de 200 µl contenant le mélange de 100 µl est inséré dans le thermocycler.
Le processus d'ACP comprend les étapes suivantes :
Initialisation. Le mélange est heated à 96°C pendant 5 minutes pour s'assurer que les brins d'ADN aussi bien que les amorces ont fondu. L'ADN polymérase Peut être présent à l'initialisation, ou il peut ajouter après cette étape.
Fondant, où il est heated à 96°C pendant 30 secondes. Pour chaque cycle, c'est habituellement assez de temps pour que l'ADN dénature.
Recuit par la chauffage à 68°C pendant 30 secondes : Les amorces se déplacent autour, entraîné par mouvement brownien. Des liaisons hydrogène le long des bouts droits courts de l'ADN sont constamment formées et cassées entre l'amorce monocatenaire et le descripteur monocatenaire. Des liens stables sont seulement formés quand l'ordre d'amorce adapte exactement l'ordre de descripteur, et sur cette partie courte d'ADN bicaténaire (descripteur et amorce), la polymérase peut attacher et commencer à copier le descripteur. Une fois que cette extension a créé un plus long segment bicaténaire d'ADN, le TM de cette région bicaténaire est maintenant plus grand que la température de recuit ou d'extension.
Élongation par 72°C de chauffage pendant 45 secondes : C'est la température fonctionnante idéale pour la polymérase. Les liaisons hydrogène combinées entre l'amorce étendue et le descripteur d'ADN sont maintenant assez fortes pour résister à des forces cassant ces attractions à température élevée. Les amorces qui sont sur des positions sans exact - s'assortissent, fondent à partir du descripteur (en raison de la température plus élevée) et ne sont pas étendues.
L'ADN polymérase Condense les 5 ' - phosphatez le groupe desdNTPs avec à la direction à 3 ' - groupes d'hydroxyle à l'extrémité du brin (étendant) naissant d'ADN, c.-à-d., la polymérase ajoute les dNTP qui sont complémentaires au descripteur dans 5 ' 3 ' direction, de ce fait lisant le descripteur dans 3 ' 5 '.
Étapes 2-4 sont répétées 25-35 fois, mais avec de bonnes amorces et polymérase fraîche, 15 à 20 cycles peuvent être suffisants.
Le mélange est tenu à 7°C. C'est utile si on commence l'ACP en soirée juste avant quitter le laboratoire, ainsi il peut fonctionner durant la nuit. L'ADN ne sera pas endommagée à 7°C après juste une nuit.
Le produit correct d'ACP peut être identifié par sa taille, utilisant l'électrophorèse de gel d'agarose. L'électrophorèse de gel d'agarose est un procédé qui se compose de l'ADN de chargement dans de petits puits d'un gel et puis d'appliquer d'agarose un courant électrique au gel. En conséquence, les brins plus petits d'ADN se déplacent plus rapidement que les brins plus grands par le gel vers le courant positif. La taille du produit d'ACP peut être déterminée en le comparant à une échelle d'ADN, qui contient des fragments d'ADN de taille connue, également chargés sur le gel (fig. 3).
Puisque l'ACP est très sensible, c.-à-d., exigeant seulement quelques molécules d'ADN pour l'amplification à travers plusieurs ordres de grandeur, des mesures adéquates d'éviter la contamination à partir de n'importe quelle ADN actuelle dans l'environnement de laboratoire (bactéries, virus, peau etc. du personnel de laboratoire) devraient être prises. Ainsi la préparation témoin d'ADN, l'assemblage du mélange de la réaction et le processus d'ACP, en plus de l'analyse de produit ultérieure de réaction, devraient tout être exécutés dans des zones séparées. Dans la pratique, une zone devrait être consacrée à une réaction avant l'ACP et à une zone différente à poteau-ACP traitant, comme l'électrophorèse ou la purification des produits d'ACP. Pour la préparation des mélanges de la réaction, un module d'écoulement laminaire avec la lampe UV est recommandé, et des pipettes avec des extrémités de filtre devraient être utilisées. Des gants frais devraient être utilisés pour chaque étape d'ACP aussi bien que des pipettes de déplacement avec des filtres d'aérosol. Les réactifs pour l'ACP devraient être préparés séparément et utilisés seulement à cette fin. Des parties aliquotes devraient être enregistrées séparément d'autres échantillons d'ADN. Une réaction de commande, omettant l'ADN de descripteur (également appelée la commande négative), devrait toujours être exécutée à côté de PCRs expérimental, pour vérifier la contamination possible des réactifs avec de l'ADN étrangère ou la formation de multimer d'amorce.
Épingles à cheveux
Les structures secondaires dans l'ADN, provoquée par le base-appareillement entre les nucléotides sur le même brin de la molécule, peuvent entraîner se plier ou même nouer du descripteur d'ADN ou des amorces, menant au rendement ou à la panne totale diminué de la réaction. Les épingles à cheveux, pliage direct de l'ADN provoquée par une série de bases complémentaires ou une inversion, sont les problèmes les plus communs de ce tri.
Typiquement, ceci nécessite choisir différentes amorces ; les structures secondaires dans l'ADN de descripteur ne sont pas aussi sérieuses que ceux dans les amorces, car l'ADN polymérase « Aplatira dehors » la plupart de descripteur de structures secondaires : Fait à moins qu'elles soient particulièrement robustes.
Cependant, si l'utilisation d'épingle à cheveux-former des amorces est nécessaire, comme peut être le cas dans l'ACP épissant et copiant, le problème peut être améliorée en quelque sorte au moyen de DMSO ou de descripteur deglycérol: Fait ; ces produits chimiques peuvent être ajoutés au mastermix d'ACP pour interrompre les structures secondaires.
Erreurs de polymérase
La polymérase de Taq manque d'une activité de l'exonuclease à 3 ' 5 '. Ceci le rend impossible pour qu'il fasse l'erreur corrigeant sur épreuves, c.-à-d., pour contrôler la dernière base qu'elle s'est insérée et pour l'exciser si la base ne s'assortit pas avec la base dans le brin complémentaire. Ce manque dans 3 ' à 5 ' corrigeant sur épreuves a comme conséquence une cadence d'erreur élevée approximativement de 1 dans 10.000 bases, qui, si une erreur se produit tôt dans l'ACP, peuvent entraîner l'accumulation d'une grande proportion d'ADN amplifiée avec l'ordre incorrect dans les produits finis. L'activité de l'exonuclease à plusieurs les ADN polymérases « De haute fidélité », ayant machiné 3 ' 5 ' sont devenus disponibles qui permettent une amplification plus précise pour l'usage dans l'amplification pour ordonnancer ou copier. Les exemples des polymérases avec l'activité de l'exonuclease à 3 ' 5 ' incluent : ADN polymérase de KOD, une forme de recombinaison du kodakaraensis KOD1 de Thermococcus ; Évent, qui est extrait à partir des litoralis de Thermococcus ; ADN polymérase de Pfu, qui est extrait à partir du furiosus de Pyrococcus ; et Pwo, qui est extrait à partir du woesii de Pyrococcus. Descripteur : Fait
Taille et d'autres limitations
L'ACP fonctionne aisément avec de l'ADN des deux à trois mille paires de base hautes dans la longueur. Cependant, au-dessus de cette taille, les rendements de produit diminuent souvent, comme avec l'augmentation des effets stochastiques de longueur tels que l'arrêt prématuré par la polymérase commencez à affecter l'efficacité de l'ACP. Il est possible d'amplifier de plus grandes parties de jusqu'à 50.000 paires de base avec un cycle de chauffage plus lent et des polymérases spéciales. Ce sont des polymérases fondues à une protéine ADN-contraignante processivity-améliorante, les faisant littéralement « collent » à l'ADN plus longue [6][7].
D'autres propriétés intéressantes des polymérases chimériques TopoTaq et PfuC2 de prototype incluent la thermostabilité, la spécificité et la résistance améliorées aux contaminants et aux inhibiteurs [8][9]. Elles ont été machinées utilisant des domaines obligatoires d'ADN de seule Spirale-épingle à cheveux-Spirale (HhH) de Topoisomerase V [10] de kandleri hyperthermophile de Methanopyrus. Les polymérases chimériques surmontent beaucoup de limitations des enzymes indigènes et sont utilisées dans l'amplification directe d'ACP des cultures de cellules et même des échantillons alimentaires, de ce fait sautant des étapes laborieuses d'isolement d'ADN tout à fait. Une activité robuste de déplacement de brin de la polymérase de TopoTaq d'hybride aide à résoudre des problèmes d'ACP avec des #Hairpins et de doubles spirales G-chargées, parce que les spirales avec un contexte élevé de CHROMATOGRAPHIE GAZEUSE possèdent une température de fonte plus élevée [11].
Amoricage non spécifique
L'attache non spécifique des amorces fréquemment se produit et peut être due aux ordres de répétition dans le descripteur d'ADN, l'attache non spécifique entre l'amorce et le descripteur, et l'attache inachevée d'amorce, laissant la ' extrémité les 5 de l'amorce sans attaches au descripteur. L'attache non spécifique est également souvent augmentée quand des amorces dégénérées sont utilisées dans l'ACP. La manipulation des concentrations en ion de la température et de magnésium derecuit (qui stabilisent les interactions d'ADN et d'ARN) peut augmenter la spécificité. L'amoricage non spécifique pendant la préparation de réaction à de plus basses températures peut être empêché par l'utilisation « chaud-démarrent » les enzymes de polymérase dont le site actif est bloqué par un anticorps ou le produit chimique qui déloge seulement une fois la réaction est chauffé à 95ËšC pendant l'étape de dénaturation du premier cycle.
Une nouvelle voie de mettre à jour les enzymes thermophiles absolument inactives à la basse température a été identifiée pendant des études structurales des enzymes ADN-contraignantes hyperthermophiles [12]. Une polymérase particulièrement machinée de TopoTaq lance immédiatement à température élevée et surmonte des limitations de conventionnel « chaud-démarrent » les enzymes qui exigent la dénaturation d'anticorps à >90ËšC pour le lancement. En outre, son activité est bloquée sur l'accomplissement de l'ACP à la basse température.
ACP emboîté - L'ACP emboîté est destiné pour augmenter la spécificité en amplifiant un ordre d'ADN de cible, et, ainsi, pour réduire le fond dû à l'amplification non spécifique de l'ADN. Deux ensembles d'amorces sont utilisés dans deux réactions successives d'ACP. Dans la première réaction, une paire d'amorces est utilisée pour produire des produits d'ADN, qui sans compter que la cible destinée, peuvent encore se composer des fragments non spécifique amplifiés d'ADN. Les produits (parfois après que purification de gel après électrophorèse du produit d'ACP) sont alors utilisés dans une deuxième réaction d'ACP à un ensemble d'amorces dont les accepteurs sont complètement ou partiellement différents des paires d'amorce utilisées dans la première réaction, mais sont également dans la cible destinée d'ADN. Ces amorces emboîtées amplifient spécifiquement l'ordre dans la cible destinée. L'ACP emboîté est souvent plus réussi en amplifiant spécifiquement de longs fragments d'ADN que l'ACP conventionnel, mais il exige la connaissance plus détaillée des ordres de cible.
ACP spécifique d'Intersequence (ISSR)
ACP Ligature-négocié
ACP inverse - L'ACP inverse est une méthode employée pour permettre l'ACP quand seulement un ordre interne est connu. C'est particulièrement utile en identifiant des ordres de flanquement à de diverses insertions genomic. Ceci implique une série de digestions et de ligature d'individu avant la coupure par une ribonucléase, ayant pour résultat des ordres connus à l'une ou l'autre fin de l'ordre inconnu.
RT-PCR - RT-PCR (ACP renversé de transcription) est une méthode employée pour amplifier, isoler ou identifier un ordre connu d'une cellule ou d'un ARN detissus. La réaction d'ACP est précédée par une réaction utilisant le transcriptase renversé pour convertir l'ARN en cDNA. RT-PCR est employé couramment dans l'expression profilant, pour déterminer l'expression d'un gène ou pour identifier l'ordre d'une transcription d'ARN, y compris des sites de début de transcription et d'arrêt et, si l'ordre genomic d'ADN d'un gène est connu, pour tracer l'emplacement des exons et des introns dans le gène. La ' extrémité les 5 d'un gène (correspondant au site de début de transcription) est typiquement identifiée par une méthode de RT-PCR, nommée RACE-PCR, abréviation l'amplification rapide des extrémités de cDNA.
ACP d'Assemblée - L'ACP d'Assemblée est la synthèse complètement artificielle de longs produits de gène en effectuant l'ACP sur un regroupement de longs oligonucléotides avec des segments superposants courts. Les oligonucléotides alternent entre le sens et les directions antisens, et les segments superposants servent à commander les fragments d'ACP de sorte qu'ils fabriquent sélectivement leurs produits finis.
ACP asymétrique - L'ACP asymétrique est employé pour amplifier préférentiellement un brin de l'ADN initiale davantage que l'autre. Il trouve l'utilisation dans quelques types de l'ordonnancement et d'hybridation sondant où avoir seulement un des deux stands complémentaires est idéal. L'ACP est effectué comme d'habitude, mais avec un grand excès des amorces pour le brin choisi. En raison de l'amplification (arithmétique) lente plus tard dans la réaction après que l'amorce limiteuse ait été épuisée, des cycles supplémentaires de l'ACP sont exigés. Une modification récente sur ce de processus, connu comme Linéaire-Après-Le-Exponentiel-ACP (LATE-PCR), des utilisations une amorce limiteuse avec une température de fonte plus élevée (TM) que l'amorce excessive de mettre à jour l'efficacité de réaction comme concentration limiteuse en amorce diminue la mi-réaction.
ACP quantitatif - Q-PCR (ACP quantitatif) est employé pour mesurer la quantité d'un produit d'ACP (de préférence temps réel). C'est la méthode de choix pour mesurer quantitativement commencer des quantités d'ADN, de cDNA ou d'ARN. Q-PCR est utilisé généralement pour déterminer si un ordre d'ADN est présent dans un échantillon et le nombre de ses copies dans l'échantillon. La méthode avec actuel le de plus haut niveau de l'exactitude est ACP quantitatif de temps réel. On le connaît embrouillant souvent comme RT-PCR (ACP en temps réel) ou RQ-PCR. QRT-PCR ou RTQ-PCR sont des contractions plus appropriées. RT-PCR se rapporte généralement à l'ACP renversé de transcription (voir ci-dessus), qui est employé souvent en même temps que Q-PCR. Les méthodes de QRT-PCR utilisent les colorants fluorescents, tels que le vert de Sybr, ou fluorophore-contenir l'ADN sonde, comme TaqMan, pour mesurer la quantité de produit amplifié en temps réel.
ACP d'atterrissage - L'ACP d'atterrissage est une variante de l'ACP qui réduit le recuit non spécifique d'amorce en abaissant graduellement la température de recuit pendant que le recyclage d'ACP progresse. La température de recuit aux cycles intial est habituellement quelques degrés au-dessus du TM des amorces utilisées, alors qu'aux cycles postérieurs, il est quelques degrés au-dessous de l'amorce TM. Les températures plus élevées donnent une plus grande spécificité pour l'attache d'amorce, et les températures plus basses permettent une amplification plus efficace des produits spécifiques formés pendant les cycles initiaux.
Chaud-démarrez l'ACP est une technique qui réduit l'amoricage non spécifique qui se produit pendant la préparation des composants de réaction. La technique peut être exécutée manuellement en chauffant simplement les composants de réaction brièvement à la température de fonte (par exemple, 95ËšC) avant d'ajouter la polymérase. On a développé des systèmes spécialisés d'enzymes qui empêchent l'activité de la polymérase à la température ambiante, par la liaison d'un anticorps ou par la présence des inhibiteurs en covalence liés qui dissocient seulement après une étape à hautes températures de lancement. Chaud-démarrez/froid-terminez l'ACP est réalisé avec des nouvelles polymérases hybrides qui sont inactives à la température ambiante et sont immédiatement lancées à la température d'élongation.
ACP de colonie - Des clones bactériens (Escherichia coli) peuvent être examinés pour les produits corrects de ligature. Des colonies choisies sont sélectionnées avec un toothpick stérile d'un plat d'agarose et tamponnées dans le mélange principal ou l'eau stérile. Des amorces (et le mélange principal) sont ajoutés - le protocole d'ACP doit être commencé par du temps étendu à 95ËšC quand la polymérase standard est utilisée ou avec raccourcissez l'étape de dénaturation à 100ËšC et à ADN polymérase Chimérique spécial [11].
MULTIPLEX-ACP - L'utilisation des positionnements multiples et seuls d'amorce dans une réaction simple d'ACP de produire des amplicons des tailles variables spécifiques à différents ordres d'ADN. En visant les familles multigéniques immédiatement, des informations supplémentaires peuvent être obtenues d'un seul essai qui autrement aurait besoin de plusieurs fois les réactifs et plus d'heure d'exécuter. Les températures de recuit pour chacun des positionnements d'amorce doivent être optimalisées pour fonctionner correctement dans une réaction simple, et les tailles d'amplicon, c.-à-d., leur longueur de base de paires, devraient être assez différentes pour former les bandes distinctes une fois visualisées par l'électrophorèse de gel.
ACP spécifique de méthylation - l'ACP spécifique de méthylation (MSP) est employé pour détecter la méthylation des îles de CpG en ADN genomic. L'ADN est d'abord préparée avec du bisulfite de sodium, qui convertit les bases unmethylated de cytosine en uracile, qui est identifié par des amorces d'ACP comme thymine. Deux réactions d'ACP sont alors effectuées sur l'ADN modifiée, utilisant des positionnements d'amorce identiques excepté à toutes les îles de CpG dans les ordres d'amorce. À ces points, un positionnement d'amorce identifie l'ADN avec des cytosines pour amplifier l'ADN méthylée, et un positionnement identifie l'ADN avec de l'uracile ou le thymine pour amplifier l'ADN unmethylated. MSP utilisant le qPCR peut également être exécuté pour obtenir quantitatif plutôt que des informations qualitatives sur la méthylation.
L'amplification Ligature-dépendante multiplex de sonde (MLPA) permet aux cibles multiples d'être amplifiées avec seulement une seule paire d'amorce, de ce fait évitant les limitations de résolution de l'ACP multiplex.
Utilisations d'ACP
L'ACP peut être utilisé pour une large variété d'expériences et d'analyses. Quelques exemples sont discutés ci-dessous.
Empreinte digitale génétique
L'empreinte digitale génétique est une technique légale employée pour identifier une personne en comparant son ADN à un échantillon donné. Un exemple est sang d'unescène du crime étant génétiquement comparée au sang d'un suspect. L'échantillon peut contenir seulement une quantité minuscule d'ADN (obtenue à partir d'une source telle que le sang, le sperme, la salive, les cheveux, ou tout autre matériel organique). Théoriquement, juste un brin simple est nécessaire. D'abord, on divise l'échantillon d'ADN en fragments utilisant restriction enzymes; then amplifies them using PCR. The amplified fragments are then separated using gel electrophoresis. The overall layout of the DNA fragments is called a DNA fingerprint. Since there is a very tiny possibility that two individuals may have the same sequences (one in several million), the technique is more effective at acquitting a suspect than proving the suspect guilty.Template:Fact
Figure 4: Electrophoresis of PCR-amplified DNA fragments. (1) Father. (2) Child. (3) Mother. The child has inherited some, but not all of the fingerprint of each of its parents, giving it a new, unique fingerprint.
Although these resulting 'fingerprints' are unique (except for identical twins), genetic relationships, for example, parent-child or siblings, can be determined from two or more genetic fingerprints, which can be used for paternity tests (Fig. 4). A variation of this technique can also be used to determine evolutionary relationships between organisms.
Detection of hereditary diseases
The detection of hereditary diseases in a given genome is a long and difficult process, which can be shortened significantly by using PCR. Each gene in question can easily be amplified through PCR by using the appropriate primers and then sequenced to detect mutations.
Viral diseases, too, can be detected using PCR through amplification of the viral DNA. This analysis is possible right after infection, which can be from several days to several months before actual symptoms occur. Such early diagnoses give physicians a significant lead in treatment.
Cloning genes
Cloning a gene, not to be confused with cloning a whole organism, describes the process of isolating a gene from one organism and then inserting it into another organism (now termed a genetically modified organism (GMO)). PCR is often used to amplify the gene, which can then be inserted into a vector (a vector is a piece of DNA which 'carries' the gene into the GMO) such as a plasmid (a circular DNA molecule) (Fig. 5). The DNA can then be transferred into an organism (the GMO) where the gene and its product can be studied more closely. Expressing a cloned gene (when a gene is expressed the gene product (usually protein or RNA) is produced by the GMO) can also be a way of mass-producing useful proteins, for example medicines or the enzymes in biological washing powders. The incorporation of an affinity tag on a recombinant protein will generate a fusion protein which can be more easily purified by affinity chromatography.
Figure 5: Cloning a gene using a plasmid. (1) Chromosomal DNA of organism A. (2) PCR. (3) Multiple copies of a single gene from organism A. (4) Insertion of the gene into a plasmid. (5) Plasmid with gene from organism A. (6) Insertion of the plasmid in organism B. (7) Multiplication or expression of the gene, originally from organism A, occurring in organism B.
Mutagenesis
Mutagenesis is a way of making changes to the sequence of nucleotides in the DNA. There are situations in which one is interested in mutated (changed) copies of a given DNA strand, for example, when trying to assess the function of a gene or in in-vitro protein evolution (also known as Directed evolution). Mutations can be introduced into copied DNA sequences in two fundamentally different ways in the PCR process. Site-directed mutagenesis allows the experimenter to introduce a mutation at a specific location on the DNA strand. Usually, the desired mutation is incorporated in the primers used for the PCR program. Random mutagenesis, on the other hand, is based on the use of error-prone polymerases in the PCR process. In the case of random mutagenesis, the location and nature of the mutations cannot be controlled. One application of random mutagenesis is to analyze structure-function relationships of a protein. By randomly altering a DNA sequence, one can compare the resulting protein with the original and determine the function of each part of the protein.
Analysis of ancient DNA
Using PCR, it becomes possible to analyze DNA that is thousands of years old. PCR techniques have been successfully used on animals, such as a forty-thousand-year-old mammoth, and also on human DNA, in applications ranging from the analysis of Egyptian mummies to the identification of a RussianTsar.
Genotyping of specific mutations
Through the use of allele-specific PCR, one can easily determine which allele of a mutation or polymorphism an individual has. Here, one of the two primers is common, and would anneal a short distance away from the mutation, while the other anneals right on the variation. The 3' end of the allele-specific primer is modified, to only anneal if it matches one of the alleles. If the mutation of interest is a T or C single nucleotide polymorphism (T/C SNP), one would use two reactions, one containing a primer ending in T, and the other ending in C. The common primer would be the same. Following PCR, these two sets of reactions would be run out on an agarose gel, and the band pattern will tell you if the individual is homozygous T, homozygous C, or heterozygous T/C. This methodology has several applications, such as amplifying certain haplotypes (when certain alleles at 2 or more SNPs occur together on the same chromosome Linkage Disequilibrium) or detection of recombinant chromosomes and the study of meiotic recombination.
Comparison of gene expression
Researchers have used traditional PCR as a way to estimate changes in the amount of a gene's expression. Ribonucleic acid (RNA) is the molecule into which DNA is transcribed prior to making a protein, and those strands of RNA that hold the instructions for protein sequence are known as messenger RNA (mRNA). Once RNA is isolated it can be reverse transcribed back into DNA (complementary DNA to be precise, known as cDNA), at which point traditional PCR can be applied to amplify the gene, this methodology is called RT-PCR. In most cases if there is more starting material (mRNA) of a gene then during PCR more copies of the gene will be generated. When the products of the PCR process are run on an agarose gel (see Figure 3 above) a band, corresponding to a gene, will appear larger on the gel (note that the band remains in the same location relative to the ladder, it will just appear fatter or brighter). By running samples of amplified cDNA from differently treated organisms one can get a general idea of which sample expressed more of the gene of interest. A quantative RT-PCR method has been developed, it is called Real-time PCR .
History
Polymerase chain reaction was invented by Kary Mullis[2][13]. He was awarded the Nobel Prize in Chemistry in 1993 for his invention, only seven years after he and his colleagues at Cetus first reduced his proposal to practice. The idea was to develop a process by which DNA could be artificially multiplied through repeated cycles of duplication driven by an enzyme called DNA polymerase.
DNA polymerase occurs naturally in living organisms. In cells it functions to duplicate DNA when cells divide in mitosis and meiosis. Polymerase works by binding to a single DNA strand and creating the complementary strand. In the first of many original processes, the enzyme was used in vitro (in a controlled environment outside an organism). The double-stranded DNA was separated into two single strands by heating it to 94°C (201°F). At this temperature, however, the DNA polymerase used at the time were destroyed, so the enzyme had to be replenished after the heating stage of each cycle. The original procedure was very inefficient, since it required a great deal of time, large amounts of DNA polymerase, and continual attention throughout the process.
Later, this original PCR process was greatly improved by the use of DNA polymerase taken from thermophilic bacteria grown in geysers at a temperature of over 110°C (230°F). The DNA polymerase taken from these organisms is stable at high temperatures and, when used in PCR, does not break down when the mixture was heated to separate the DNA strands. Since there was no longer a need to add new DNA polymerase for each cycle, the process of copying a given DNA strand could be simplified and automated.
One of the first thermostable DNA polymerases was obtained from Thermus aquaticus and was called "Taq." Taq polymerase is widely used in current PCR practice. A disadvantage of Taq is that it sometimes makes mistakes when copying DNA, leading to mutations (errors) in the DNA sequence, since it lacks 3'→5' proofreading exonuclease activity. Polymerases such as Pwo or Pfu, obtained from Archaea, have proofreading mechanisms (mechanisms that check for errors) and can significantly reduce the number of mutations that occur in the copied DNA sequence. However these enzymes polymerise DNA at a much slower rate than Taq. Combinations of both Taq and Pfu are available nowadays that provide both high processivity (fast polymerisation) and high fidelity (accurate duplication of DNA).
PCR has been performed on DNA larger than 10 kilobases, but the average PCR is only several hundred to a few thousand bases of DNA.
The problem with long PCR is that there is a balance between accuracy and processivity of the enzyme. Usually, the longer the fragment, the greater the probability of errors.
Patent wars
The PCR technique was patented by Cetus Corporation, where Mullis worked when he invented the technique in 1983. The Taq polymerase enzyme is also covered by patents. There have been several high-profile lawsuits related to the technique, including an unsuccessful lawsuit brought by DuPont. The pharmaceutical company Hoffmann-La Roche purchased the rights to the patents in 1992 and currently holds those that are still protected.
A related patent battle over the Taq polymerase enzyme is still ongoing in several jurisdictions around the world between Roche and Promega. Interestingly, it seems possible that the legal arguments will extend beyond the life of the original PCR and Taq polymerase patents, which expired on March 28, 2005.[14]
