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Jason peu - assistance technique de technologies moléculaires de Dojindo
Fond du comptage de cellules Kit-8
Le comptage de cellules Kit-8 (CCK-8) permet des analyses commodes utilisant le sel du tetrazolium de Dojindo, WST-8 (2 (2-methoxy-4-nitrophenyl) - 3 (4-nitrophenyl) - 5 (2,4-disulfophenyl) - 2H-tetrazolium, sel monosodique), qui produit un colorant formazan hydrosoluble sur le bioreduction en présence d'un porteur d'électron, 1-Methoxy PMS. La solution CCK-8 est ajoutée directement aux cellules ; aucun prémélanger des composants n'est exigé. CCK-8 est une analyse colorimétrique non radioactive sensible pour déterminer le nombre de cellules viables dans des analyses de prolifération et de cytotoxicité de cellules. WST-8 bioreduced par les déshydrogénases cellulaires à un produit formazan orange qui est soluble dans le milieu de culture de tissu. La quantité de formazan produit est directement proportionnelle au nombre de cellules vivantes. La sensibilité de détection des analyses de prolifération de cellules utilisant WST-8 est plus haute que des analyses utilisant les autres sels de tetrazolium tels que MTT, XTT, MTS ou WST-1.
<ref>TReview - « pourquoi est le nécessaire formazan hydrosoluble ? » est available</ref>
Matériaux requis pour le comptage de cellules Kit-8
Lecteur de Microplate : 450-490 filtre de nanomètre
microplate de 96 puits
Multipippet (canal 8 ou 12 pour UL 10 - 100)
Incubateur C02
Compteur de cellules ou Hematocytometer
Procédé du comptage de cellules Kit-8
Étapes
Le procédé d'analyse 1. préparent une suspension de cellules avec 50.000-100.000 cells/ml utilisant un milieu de culture approprié.
2. Additionnez 100 µl de la suspension de cellules à chacun bien d'un plat de 96 puits.
3. Príncubez le plat à 37 ºC.a)
4. Ajoutez 10 µl de diverses concentrations d'une solution pour être testedb) à chacun bien.
5. Incubez le plat à 37 ºC pendant une certaine période de temps, telle que 24, 48 ou 72 heures.
6. Ajoutez 10 le solutionc d'µl CCK-8) à chacun bien, et incubez le plat à 37 ºC pour 1-4 hours.d)
7. Lisez l'O.D. à 450 nanomètre pour déterminer la viabilité de cellules dans chacun bien.
a) La préincubation durant la nuit dans un incubateur de CO2 est recommandée. b) Employez le milieu de culture ou le PBS pour préparer les solutions. c) Si la solution à tester a des activités réductrices, incubez la solution et le CCK-8 sans cellules pour déterminer l'absorbance de fond à 450 nanomètre. Si l'absorbance est négligeablement petite, ajoutez la solution CCK-8 à chacun bien. Si l'absorbance est haute, retirez le milieu de culture et lavez les cellules deux fois avec le support, alors additionnez 100 µl de la solution de milieu de culture et 10 d'µl CCK-8. d) Une plus longue incubation peut être nécessaire pour des cellules de leucocyte.
Notes du comptage de cellules Kit-8
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Protocole du comptage de cellules Kit-8
1. Combien de cellules devraient là être dans un puits ? Pour les cellules adhésives, au moins 1.000 cellules sont nécessaires par puits (support de 100 µl) à l'aide d'un plat standard de 96 puits. Pour des leucocytes, au moins 2.500 cellules sont nécessaires par puits (support 100µl) en raison de la basse sensibilité. Le nombre maximum recommandé des cellules par bien pour le plat de 96 puits est 25.000. Si 24 plats bons ou 6 bons sont utilisés pour cette analyse, calculez s'il vous plaît le nombre de cellules par puits en conséquence, et ajustez le volume de la solution CCK-8 dans chacun bien sur 10% de tout le volume.
2. Ce kit peut-il être utilisé avec un plat de 364 puits ? Oui, vous pouvez utiliser ce kit pour un plat de 384 puits. Ajoutez la solution CCK-8 avec 1/10 volume du milieu de culture dans un puits. Si le volume de CCK-8 à ajouter est CCK-8 trop petit et dilué dans la moitié avec le support et pour ajouter 1/5 du volume du milieu de culture dans un puits.
3. CCK-8 souille-t-il les cellules viables ? Pas, il ne souille pas les cellules viables parce qu'un sel hydrosoluble de tetrazolium (WST-8) est utilisé pour la solution CCK-8. Le médiateur d'électron, 1-Methoxy PMS, reçoit des électrons des cellules viables et transfère les électrons à WST-8 dans le milieu de culture. Puisque son colorant formazan est également fortement hydrosoluble, CCK-8 ne peut pas être utilisé pour la souillure de cellules.
4. Le rouge de phénol affecte-t-il l'analyse ? Numéro. La valeur d'absorption du rouge de phénol dans le milieu de culture peut être enlevée en soustrayant la valeur d'absorption d'une solution blanc de la valeur d'absorption de chacun bien. Par conséquent, le milieu de culture contenant le rouge de phénol peut être utilisé pour l'analyse CCK-8.
5. Y a-t-il une corrélation entre CCK-8 et l'analyse d'incorporation de thymidine ? Oui. Cependant, notez s'il vous plaît que puisque CCK-8 utilise un mécanisme différent d'analyse de cela de l'analyse de thymidine, les résultats peuvent différer. Des données de comparaison sont affichées dans le manuel technique, qui est disponible chez www.dojindo.com/tm.
6. CCK-8 est-il toxique aux cellules ? CCK-8 la solution lui-même est cytotoxique en raison de la concentration élevée de 1-Methoxy PMS. CCK-8 dans le milieu de culture, cependant, n'est pas cytotoxique en raison de la dilution de dix fois avec le milieu de culture. Par conséquent, la longue incubation, telle que durant la nuit et plusieurs jours, sont possibles. La même culture de cellules peut être utilisée pour d'autres analyses de prolifération de cellules, telles que l'analyse de violette en cristal, l'analyse rouge neutre ou les analyses fluorométriques d'ADN après que l'analyse CCK-8 soit terminée. Puisque chaque cellule a la tolérance différente à CCK-8, incubez les cellules avec la solution CCK-8 et contrôlez la viabilité de cellules si un plus long temps d'incubation est nécessaire.
7. Combien la gamme de produits est-elle CCK-8 ? CCK-8 est stable plus de 6 mois à la température ambiante et à un an à 0-5 ºC avec la protection contre la lumière. Pour un entreposage plus prolongé, nous recommandons la condition de stockage de -20 ºC ; CCK-8 est stable sur 2 ans à -20 ºC.
8. Je n'ai pas un filtre de 450 nanomètre. Que d'autres filtres peuvent-ils j'utiliser ? Vous pouvez utiliser des filtres avec l'absorbance entre 450 nanomètre et 490 nanomètre.
Références pour le comptage de cellules Kit-8
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