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Obtenant la qualité, l'ARN intact est la première et souvent la plus critique étape en exécutant beaucoup d'expériences fondamentales de biologie moléculaire, y compris l'analyse nordique, les analyses de protection de nucléase, le RT-PCR, l'ARN traçant, la traduction in vitro et la construction de bibliothèque de cDNA. Pour être réussi, cependant, le procédé d'isolement d'ARN devrait inclure quelques étapes importantes toutes les deux avant et après la purification réelle d'ARN.
Selon l'ARN à extraire, il y a des propriétés de l'ARN qui lui permettent d'être isolé à partir d'autres matériaux cellulaires tels que des protéines, ADN et même lipides.
L'ARN de messager ou l'ADN messagère contient des résidus d'une adénosine de bout droit sous forme de poly (A) queue. Ceci a été exploité pour permettre à l'ADN messagère d'être lié à poly (T) des colonnes ou des programmes d'affinité.
Si vous avez actuel une méthode préférée pour isoler l'ARN, continuez à l'utiliser.
Si vous n'avez pas isolé l'ARN de votre système avant qu'et votre organization ne soit pas sur la liste suivante, nous pouvons vous aider à identifier les protocoles établis qui ont été utilisés pour isoler l'ARN pour le transfert de Northern ou le RT-PCR de votre système. Ces types de protocoles rapporteront également l'ARN de « microarray-catégorie ».
Exécutez toujours un gel d'agarose de votre ARN pour évaluer la qualité.
NOTE : Si vous utilisez non un réactif de purification basé par colonne tel que TRIzol que nous vous recommandons précipitons votre ARN une deuxième fois d'éthanol ou vous le passez par une colonne de Rneasy ou un dispositif semblable. Ceci assure le déplacement de tous les contaminants organiques (voir les spectres ci-dessous).
Fractionnement nucléaire/cytoplasmique efficace peut être rapidement évalué en dénaturant l'analyse de gel d'agarose (voir le schéma 1). Les bandes correspondant au rRNA de précurseur devraient être équivalentes dans la fraction totale et nucléaire d'ARN. Les bandes du rRNA 18S et 28S seront moins intenses dans la fraction nucléaire d'ARN qu'en ARN de total ou ARN cytoplasmique de fraction. Dans quelques variétés de cellule, par exemple 293 et cellules COS-7, cette différence sera excessive, mais en autres cellules tel que les cellules hela, les bandes de rRNA sont alignées seulement légèrement moins intenses en ARN nucléaire qu'en ARN total ou cytoplasmique de fraction. «
Les lectures A260 et 260/280 de taux ne sont pas assez pour assurer l'ARN de grande pureté. Vous devez prendre un plein spectre UV. Sont ci-dessous 3 spectres d'exemple que tous ont bon 260/280 de taux, mais ont des puretés très différentes. Vous pouvez également employer le taux de 260/230 pour aider à déterminer la quantité de contamination organique en votre ARN. C'est un nombre beaucoup plus variable que le taux de 260/280, mais généralement, les taux au-dessus de 1 indiquent la bonne pureté.
Des cellules ont été alors lavées dans PBS et ont successivement extrait comme décrit. D'abord, des cellules ont été extraites au moyen la mémoire tampon de Nonidet P-40 (10 millimètres de Tris-Cl, (pH 7.5), 10 millimètres de NaCl, 3 millimètres de mgcl2, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 millimètre DTT). Le granule restant (bonnet endoplasmique rugueux (RER) et noyau) a été lavé dans la même mémoire tampon et extrait dans la mémoire tampon B (10 millimètres de Tris-Cl (pH 7.5), 10 millimètres de NaCl, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, EDTA de 40 millimètres, 40 units/ml Rnasin, 1 millimètre DTT). Le granule nucléaire restant a été lavé dans la même mémoire tampon et extrait au moyen la mémoire tampon élevée de sel (10 millimètres de Tris-Cl (pH 7.5), NaCl de 0.5 M, 3 millimètres de mgcl2, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 millimètre DTT). L'ARN a été purifié de chaque fraction par la solution de stat d'ARN. L'ARN total a été isolé utilisant le réactif RNA-STAT60 (Téléphone-essai) selon les instructions fournies par le constructeur. (Référence : Byeong-Rustre Jang et autres, 2002)
Pour 100 mls 200 mls
4. EDTA 0.5M du sulfocyanate 53.2 g 106.4 2% N-lauroylsarcosine (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mM de 5M Guanidinium 10 Tris-HCL des mls 25mM des mls 20, pH 7.5 1M 2.5 mls 5 mls
0. b-mercaptoéthanol 700ul 1.4mls de 1M
0. antimousses A (sigma) de 2% 200 UL de l'UL 400
5. volume final de cushion* de 7 M CsCl 100 ml
5. 7 M CsCl « cuit au four » 95.8g
0. EDTA 0.5M de 1M 20 mls
* Utilisez l'eau traitée par DEPC et la verrerie cuite au four. Cette solution, absolument, franchement doit être RNase librement. La RNase est partout ! Portez les gants, la verrerie cuite au four d'utilisation seulement, ou le plastique vierge. Festin de DePC votre eau, mémoires tampons (excepté Tris). Faites attention très.
1. Pesez l'animal. Retirez l'organe (foie), pesez un des attributs supérieurs du cDNA est vous réduisent la complexité de gène en choisissant un organe qui exprime seulement un lieu simple d'une enzyme de multilocus. 2. Homogénéisez le tissu rapidement dans la rotation 3. de la mémoire tampon de « chaos » (9mls) homogenant à 12 kilogrammes pour enlever le matériel insoluble 4. TANDIS QUE Homogenant TOURNE 4A. Alourdissez 1.8 g de CsCl (0.2g/ml) par échantillon. 4B. Dans le tube d'ultracentrifugeuse (« rapide-joint ») ajoutez 3.5mls de 5.7M CsCl « coussin » que cette couche doit être RNase librement. Vous centrifugerez votre ARN par cette couche et n'importe quelle contamination entraînera des pertes significatives. 5. Retirez supernant, mis dans le tube frais, additionnez 1.8 g CsCl 6. soigneusement, ajoutez homogenant sur le coussin de CsCl. Ce fait le plus aisément en utilisant une seringue 10cc et une longue aiguille. Placez l'aiguille/seringue dans le tube de rapide-joint, et ajoutez le tissu homogenant à la seringue. Homogenant s'écoulera goutte à goutte lentement dans le tube de Q-S, flottant sur le coussin.
7. Soigneusement, paires appariées d'équilibre de tube à centrifuger (+-0.005 g).
8. Tubes de joint, opposé de tubes apparié par endroit de l'un l'autre et chapeau avec les dessus en aluminium rouges.
9. Centrifugeuse, 50.000 rpms 5.5 heures, 20oC
Après centrifugation : Marquez les tubes où le granule devrait être : du côté externe inférieur (relativement au centre du rotor)
10. Retirez les tubes, les placez dans l'armoire commode.
11. Découpez en tranches outre du dessus du tube. Aspirez outre du 2/3- principal 3/4 de la solution. FONCTIONNEZ À PARTIR DU DESSUS VERS LE BAS. IL EST IMPORTANT QUE VOUS ASPIRIEZ OUTRE DU HAUT LA PLUPART DE SOLUTION D'ABORD ET RETIRIEZ TOUT SAUF LE COUSSIN CLAIR. N'ASPIREZ PAS LE GRANULE INVISIBLE AU BAS.
12. Découpez le 2/3 principal du tube. Utilisant un Pasteur « tiré » introduisez à la pipette, retirez soigneusement la solution restante. Le granule sera sur le dessous du tube.
13. Rincez le granule avec 70% EtOH, le retirez (l'utilisation Pasteur introduit à la pipette), le répétez deux fois (le total 3 lave)
14. Ajoutez l'UL 200 de 0.1x TE (RNase libre), utilisant l'extrémité d'introduire à la pipette au granule et à « titrer » d'écrasement la tentative de T.E. de mettre le granule dans la solution. Formez au moins une solution hétérogène et mettez dans un tube frais de microfuge.
15. Répétez avec l'UL 200 du T.E. mettant les deux solutions
16. Le vortex, bon ARN n'aime pas entrer dans la solution. La patience est une vertu.
17. Déterminez la concentration, l'UL 10 dans l'UL 490 (500 UL les vol. finaux)
18. Éliminent 1 à 2 ug d'ARN pour l'analyse de gel (ajoutent des mémoires tampons de chargement d'ARN)
19. Ajoutent la RNase 3M libre NaOAC (40 UL), 2.5 volumes de 1/10 volume d'EtOH (1.0ml). Mélange vigoureusement.
20. Vous pouvez calculer la concentration de l'ARN dans l'EtOH.Thus, là n'est aucun besoin de précipiter tout votre ARN immédiatement. Juste enlevez environ 1.5 à 2 fois la quantité que vous avez besoin par vortexing la solution d'EtOH/RNA et enlevez le volume approprié. Cette solution d'EtOH/RNA enregistrée à 20oC ou s'abaissent, sont stable pendant des années.
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