Bienvenue à la station moléculaire !

Vous devez vous enregistrer avant que vous puissiez signaler sur nos forum ou utiliser nos dispositifs avançés. Registre Maintenant ! Son libre et rapide !

Déjà enregistré ? Procédure de connexion maintenant ci-dessous.

Déjà enregistré et a oublié votre mot de passe ? Clic ci-dessous pour le récupérer.

Récupérez Le Mot de passe Perdu

Joignez maintenant - il est rapide et libre !

La station moléculaire est le plus grand réseau des chercheurs, des scientifiques et des amoureux de la science n'importe où !

Biologie Moléculaire - Guillemet de la Science

Est la recherche ce que je fais quand je ne sais pas ce que je fais. Von Braun de ~Wernher

Bulletin Moléculaire de Biologie !

Poteaux Récents de Forum

Isolement d'ARN

Information de fond d'Extraction d'ARN

Obtenant la haute qualité, l'ARN intact est le premier et souvent l'étape la plus critique dans l'exécution beaucoup de biologie moléculaire fondamentale expérimente, construction y compris l'analyse nordique, les analyses de protection de nucléase, le RT-PCR, l'ARN traçant, la traduction in vitro et d'ADN bibliothèque. Être réussi, cependant, le procédé d'isolement d'ARN devrait inclure quelques étapes importantes toutes les deux avant et après la purification réelle d'ARN.

Méthodes de base d'Isolement d'ARN

Dépendent de l'ARN à extraire, là des propriétés de l'ARN qui lui permettent d'être isolé loin dans d'autres matériaux cellulaires tels comme protéines, ADN et même lipides.

L'ARN ou le mRNA de messager contient des résidus d'une adénosine de bout droit sous forme de queue de poly(A). Ceci a été exploité pour permettre au mRNA d'être lié aux colonnes ou aux petits programmes d'affinité de poly(T).

Extrémités pour l'extraction et l'isolement d'ARN

Si vous avez actuel une méthode préférée pour isoler l'ARN, continuez à l'utiliser.

Si vous n'avez pas isolé l'ARN de votre système avant qu'et votre organization ne soit pas sur la liste suivante, nous pouvons vous aider à identifier les protocoles établis qui ont été utilisés pour isoler l'ARN pour éponger nordique ou le RT-PCR de votre système. Ces types de protocoles rapporteront également l'ARN de "microarray-catégorie".

Exécutez toujours un gel d'agarose de votre ARN pour évaluer la qualité.

NOTE : Si vous utilisez non un réactif de purification basé par colonne tel que TRIzol que nous vous recommandons précipitons votre ARN une deuxième fois d'éthanol ou vous le passez par une colonne de Rneasy ou un dispositif semblable. Ceci assure le déplacement de tous les contaminants organiques (voir des spectres ci-dessous).

Inhibiteurs de RNase utilisés dans l'extraction et l'isolement d'ARN

Contrôle de la qualité et de la quantité d'isolement d'ARN

Le fractionnement efficace de nuclear/cytoplasmic peut être rapidement évalué par analyse dénaturante de gel d'agarose (voir le schéma 1). Les bandes correspondant au rRNA de précurseur devraient être équivalentes dans la fraction totale et nucléaire d'ARN. Les bandes du rRNA 18S et 28S seront moins intenses dans la fraction nucléaire d'ARN qu'en ARN de total ou ARN cytoplasmique de fraction. Dans quelques lignes de cellules, par exemple 293 et cellules COS-7, cette différence sera excessive, mais en autres cellules tel que les cellules hela, les bandes de rRNA sont alignées seulement légèrement moins intenses en ARN nucléaire qu'en ARN total ou cytoplasmique de fraction."

Pureté d'ARN

Les lectures A260 et 260/280 de taux ne sont pas assez pour assurer l'ARN de grande pureté. Vous devez prendre un plein spectre UV. Au-dessous de sont 3 spectres d'exemple que tous ont bon 260/280 de taux, mais ont des puretés très différentes. Vous pouvez également utiliser le taux de 260/230 à l'aide déterminez la quantité de contamination organique en votre ARN. C'est un nombre beaucoup plus variable que le taux de 260/280, mais généralement, les taux au-dessus de 1 indiquent la bonne pureté.

Mesure de l'extraction et de l'isolement d'ARN

Isolement d'ARN dans les fractions sous-cellulaires

Des cellules ont été alors lavées dans PBS et ont successivement extrait comme décrit. D'abord, des cellules ont été extraites au moyen la mémoire tampon de Nonidet P-40 (10 millimètres de Tris-Cl, (pH 7.5), 10 millimètres de NaCl, 3 millimètres de mgcl2, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 millimètre DTT). Le granule restant (bonnet endoplasmique rugueux (RER) et noyau) a été lavé dans la même mémoire tampon et extrait dans la mémoire tampon B (10 millimètres de Tris-Cl (pH 7.5), 10 millimètres de NaCl, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, EDTA de 40 millimètres, 40 units/ml Rnasin, 1 millimètre DTT). Le granule nucléaire restant a été lavé dans la même mémoire tampon et extrait au moyen la mémoire tampon élevée de sel (10 millimètres de Tris-Cl (pH 7.5), NaCl de 0.5 M, 3 millimètres de mgcl2, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 millimètre DTT). L'ARN a été purifié de chaque fraction par la solution de stat d'ARN. L'ARN total a été isolé en utilisant le réactif RNA-STAT60 (Téléphone-essai) selon les instructions fournies par le constructeur. (référence : Byeong-Churl Jang et autres, 2002)

Isolement d'ARN En utilisant Le Protocole de CsCl

Mémoire tampon de chaos pour l'isolement d'ARN

Pour 100 mls 200 mls

4. EDTA 0.5M du sulfocyanate 53.2 g 106.4 2% N-lauroylsarcosine (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mM de 5M Guanidinium 10 mls 20 mls 25mM Tris-HCl, mls du 1M 2.5 de pH 7.5 5 mls

0. b-mercaptoéthanol 700ul 1.4mls de 1M

0. anti-mousse A (sigma) de 2% 200 UL de l'UL 400

5. coussin de 7 M CsCl * volume final 100 ml

5. 7 M CsCl "Cuit au four" 95.8g

0. EDTA 0.5M de 1M 20 mls

Procédé d'Extraction d'ARN En utilisant CsCl

* Utilisez l'eau traitée par DEPC et la verrerie cuite au four. Cette solution, absolument, franchement doit être RNase librement. La RNase est partout ! Portez les gants, la verrerie cuite au four d'utilisation seulement, ou le plastique vierge. Festin de DePC votre eau, mémoires tampons (excepté Tris). Faites attention très.

1. Pesez l'animal. Retirez l'organe (foie), pesez un des attributs supérieurs de l'ADN est vous réduisent la complexité de gène en choisissant un organe qui exprime seulement un lieu simple d'une enzyme de multilocus. 2. Homogénéisez le tissu rapidement dans la mémoire tampon de "chaos" (9mls) 3. Tournez homogenant à 12 kilogrammes pour enlever le matériel insoluble 4. TANDIS QUE Homogenant TOURNE 4A. Alourdissez 1.8 g de CsCl (0.2g/ml) par échantillon. 4B. Dans le tube d'ultracentrifugeuse ("rapide-joint") ajoutez 3.5mls de 5.7M CsCl "coussin" que cette couche doit être RNase librement. Vous centrifugerez votre ARN par cette couche et n'importe quelle contamination causera des pertes significatives. 5. Retirez supernant, mis dans le tube frais, additionnez 1.8 g CsCl 6. Soigneusement, ajoutez homogenant sur le coussin de CsCl. Ce fait le plus aisément en utilisant une seringue 10cc et une longue aiguille. Placez needle/syringe dans le tube de rapide-joint, et ajoutez le tissu homogenant à la seringue. Homogenant s'écoulera goutte à goutte lentement dans le tube de Q-S, flottant sur le coussin.

7. Soigneusement, l'équilibre a apparié des paires de tube à centrifuger (+-0.005 g).

8. Les tubes de joint, endroit ont apparié l'opposé de tubes de l'un l'autre et du chapeau avec les dessus en aluminium rouges.

9. Centrifugeuse, 50.000 rpms 5.5 heures, 20oC

Après centrifugation : Marquez les tubes où le granule devrait être : du côté externe inférieur (relativement au centre du rotor)

10. Retirez les tubes, les placez dans l'armoire commode.

11. Découpez en tranches outre du dessus de tube.Aspirate outre du 2/3- principal 3/4 de la solution. TRAVAILLEZ À PARTIR DU DESSUS VERS LE BAS. IL EST IMPORTANT QUE VOUS ASPIRIEZ OUTRE DU HAUT LA PLUPART DE SOLUTION D'ABORD ET RETIRIEZ TOUT SAUF LE COUSSIN CLAIR. N'ASPIREZ PAS LE GRANULE INVISIBLE AU BAS.

12. Découpez le 2/3 principal du tube. En utilisant un Pasteur "tiré" introduisez à la pipette, retirez soigneusement la solution restante. Le granule sera sur le bas-côté du tube.

13. Rincez le granule avec 70% EtOH, le retirez (l'utilisation Pasteur introduit à la pipette), le répétez deux fois (le total 3 lave)

14. Ajoutez l'UL 200 de 0.1x TE (RNase libre), utilisation introduisent à la pipette l'extrémité pour écraser le granule et "titrer" la tentative de T.E. de mettre le granule dans la solution. Formez au moins une solution hétérogène et mettez dans un tube frais de microfuge.

15. Répétez avec l'UL 200 de T.E. mettant les deux solutions

16. Le vortex, bon ARN n'aime pas entrer dans la solution. La patience est une vertu.

17. Déterminez la concentration, l'UL 10 dans l'UL 490 (500 UL vol. final)

18. Éliminez 1 à 2 ug d'ARN pour l'analyse de gel (ajoutez les mémoires tampons de chargement d'ARN)

19. Ajoutez la RNase librement 3M NaOAC (de 1/10 volume UL 40), 2.5 volumes EtOH (1.0ml). Mélange vigoureusement.

20. Vous pouvez calculer la concentration de l'ARN dans EtOH.Thus, là n'est aucun besoin de précipiter tout votre ARN immédiatement. Juste enlevez environ 1.5 à 2 fois la quantité que vous avez besoin par vortexing la solution EtOH/RNA et enlevez le volume approprié. Cette solution EtOH/RNA enregistrée à 20oC ou s'abaissent, sont stable pendant des années.

Voyez :