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Gels d'ARN

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Histoire de l'électrophorèse de gel d'ARN

Des gels d'ARN ont été employés pendant des décennies pour séparer dehors et pour évaluer qualitativement la qualité de l'ARN d'isolement des échantillons. Si vous n'êtes pas sûr quel ARN est contrôle :

SONORE Écoutez une explication détaillée d'ARN! et voir le notre article d'encyclopédie d'ARN.

Électrophorèse de Gel d'ARN - Information de fond

Après l'isolement des échantillons d'ARN, la qualité de la préparation d'isolement d'ARN est habituellement évaluée par l'électrophorèse sur un gel dénaturant d'agarose. Bien que les résultats soient principalement qualitatifs, vous pouvez obtenir quelques informations sur le rendement de l'ARN aussi bien.

Dénaturant des gels sont utilisés parce que l'ARN tend à se plier sur lui-même et à former la structure secondaire étendue et stable par l'intermédiaire de l'appareillement de base intramoléculaire. Cette structure secondaire de l'ARN l'empêche de passer principalement selon sa taille.

Assurez-vous que vous incluez une commande positive d'ARN sur le gel, dans le cas que vous obtenez des résultats peu communs que vous pouvez alors déterminer si le problème était avec le gel ou était un problème avec l'ARN vous analysez. Vous pouvez également utiliser des repères de poids moléculaire d'ARN, un échantillon d'ARN connu pour être intact, ou tous les deux, peuvent être utilisés à cette fin.

Des gels d'ARN sont visualisés avec du bromure d'éthidium souillant pendant que le bromure d'éthidium intercale entre la structure secondaire des molécules d'ARN et permet à l'ARN d'être vu sous la lumière UV.

L'ARN est séparé dehors par l'électrophorèse de gel (habituellement électrophorèse de gel d'agarose). Après exécution d'un gel d'ARN vous pouvez conduire une tache nordique avec le transfert ultérieur à la membrane, à l'hybridation avec la sonde, et finalement à la détection. Ou simplement (et beaucoup plus rapide), tache pour l'ARN en utilisant le bromure d'éthidium ou le SYBR (ou le colorant semblable - meilleur en tant que lui est non-toxique et plus sûr).

 

Applications des gels d'ARN

Car il est beaucoup plus pénible terminer les taches nordiques que des gels d'ARN et PCR en temps réel, elles ne sont pas utilisées autant que des gels d'ARN.

L'électrophorèse de gel d'ARN et ses variations sont utilisées dans la recherche moléculaire de biologie :

• détectez l'ARN
• analyse pour la qualité de l'ARN d'isolement
• tenez compte de la détermination générale de la quantité ou du rendement d'ARN
• analyse pour la dégradation d'ARN

Inconvénients des gels d'ARN

Les inconvénients d'utiliser l'électrophorèse de gel d'ARN inclut :

• Les gels d'ARN ne sont pas très quantitatifs. Vous ne pouvez pas déterminer avec précision le rendement d'ARN ou vous élever même avec des normes. Les méthodes radioactives telles que les taches nordiques d'éponger ou de point sont beaucoup plus précises.
• Souvent le bromure d'éthidium est employé pour détecter l'ARN. Le bromure d'éthidium est un biohazard car il est mutagénique et toxique.
• Les gels d'ARN tiennent compte d'une détermination rapide de rendement d'ARN cependant ne sont pas aussi rapidement que la spectrophotométrie UV ou d'autres méthodes.

Avantages des gels d'ARN

Les avantages des gels d'ARN incluent :

• C'est une méthode largement reçue
• Les gels d'ARN sont très rapides et faciles pour exécuter
• Vous pouvez analyser pour la qualité d'ARN dans un délai de 1-2 heures
• Si vous utilisez un SYBR ou une tache non-toxique différente (c.-à-d. vous n'utilisez pas le bromure d'éthidium), les gels d'ARN sont tout à fait sûrs.

Protocole de Gel d'ARN

Pour vérifier l'intégrité de votre ARN vous devriez faire une analyse"de tache nordique ". Afin d'accomplir ceci vous devez exécuter un gel dénaturant.

Pour des Mini-gels aux Midi-gels de l'utilisation d'ARN : Faites 50 mL-100mL

Pour méga-gels faites 400 ml.

 

Pour le gel 100mL (le plus généralement exécuté) vous devez ajouter 1g de l'agarose pour faire la solution d'agarose de 1%.

 

Recette courante de mémoire tampon pour des gels d'ARN

Pour préparer :	500mls	750 mls	1.5 litre
mémoire tampon du 1X E (50X)-below	10 ml	15 ml	30 ml
formaldéhyde de 0.66M (1/19 du vol.)	26.3 ml	39.5 ml	79 ml

ARN Dénaturant des Réactifs

Pour préparer 400ul de l'ARN dénaturant le réactif :

Ajoutez ce qui suit :

• 300ul Foramide-désionisé par 80%
• 3.7 % d'UL du formaldéhyde 40
• UL de la mémoire tampon 8 du 1X 50X E
• dH2O = 400ul 52ul

mémoire tampon de 50 X E par litre

Ajoutez :

• 0.9 M Na2 HPO4 127.8 dibasiques g
• 0.1M NaH2PO4 g 13.8 monobasique

Protocole : Étapes en préparant un gel d'ARN

1. mettez l'agarose dans les solutions.
2. Chauffez la solution préparée dans le flacon tissu-branché
3. Laissez frais à 60°C
4. Ajoutez le formaldéhyde à l'égale 0.66M 2.7 ml 4.0 5.3 21.2
5. (ajoutez le bromure d'éthidium si vous l'utilisez dans le flacon)
6. Versez le gel (dans le capot si possible).
7. Chauffez 2 ug d'ARN à 75°C pendant 10 mn, puis refroidissez vite (ceci permettra à l'ARN de dénaturer et rester simple-échoué).
8. Ajoutez : 2.5 vol. de l'ARN dénaturant le réactif
9. Ajoutez 1/10 vol. de colorant de chargement aux échantillons.
10. Chargez les échantillons sur des puits de gel d'agarose.
11. Exécutez le gel (habituellement volts 100V) pendant les heures 30minutes-2. (ARN de contrôle fonctionnant en utilisant des repères de colorant)

Extrémités pour des gels d'ARN

Exécutez toujours un gel d'agarose de votre ARN pour évaluer la qualité. Comptent non seulement seulement les résultats UV de spectrophotométrie.

* Utilisez l'eau traitée par DEPC et la verrerie cuite au four pour toutes les étapes. Les mémoires tampons doivent être RNase librement ou utiliser l'eau épurée par Milipore si vous êtes dans des précipitations. La RNase est partout ! Portez les gants, la verrerie cuite au four d'utilisation seulement, ou le plastique vierge. Festin de DePC votre eau, mémoires tampons (excepté Tris). Faites attention très.

 

Gels de Dépannage d'ARN

Si vous avez actuel une méthode préférée pour exécuter l'ARN, continuez à l'utiliser.

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Références de Gel d'ARN