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Tache nordique

Copyright 2007 - Station moléculaire

L'ACOUSTIQUEAcoustique de biologie moléculaireécoutent une explication nordique détaillée de tache !

Histoire du transfert de Northern

Le transfert de Northern est une technique épongeante d'ARN qui a été développée en 1977 par Alwine et autres à l'Université de Stanford (référence : 1). Il a été baptisé du nom de la technique méridionale de tache qui éponge pour l'ADN, inventée par Edwin M. méridional en 1975. La tache occidentale, une méthode pour éponger pour des protéines est également un jeu sur la tache méridionale nommant et a été nommée en 1981 (référence : 2).

Information de fond - technique nordique de tache

L'analyse nordique en dépit de son âge dans le monde de pointe de l'ACP, des analyses de protection de nucléase (RPAs) et des microarrays en temps réel, est toujours l'or-standard pour la détection et la quantitation des niveaux d'ADN messagère. C'est parce que l'analyse nordique de tache permet une comparaison directe de l'abondance d'ARN de messager entre les échantillons sur une membrane simple.

Dans la tache nordique la différence principale entre les autres techniques épongeantes est que l'ARN est le facteur étant détecté. En outre, étant donné que l'ARN est habituellement monocatenaire, elle crée les structures secondaires complexes qui affectent son transfert et par conséquent dénaturant des conditions sont utilisés pour exécuter les gels (à la différence de méridional).

L'ARN est séparé dehors par l'électrophorèse de gel de RNA (habituellement électrophorèse de gel d'agarose), le transfert ultérieur à la membrane, l'hybridation avec la sonde, et finalement la détection.

tache nordique

 

 

De même au transfert de Southern, les sondes d'hybridation peuvent être ADN ou ARN dans le transfert de Northern.

Une variante du procédé connu sous le nom de tache nordique renversée de temps en temps (bien que, rarement) a été utilisée. De ce procédé, le substrat l'acide que nucléique (qu'est apposé à la membrane) est une collection de fragments d'isolement d'ADN, et la sonde est ARN extrait à partir d'un tissu et radioactivement étiqueté.

L'utilisation des microarrays d'ADN qui ont hérité l'utilisation répandue vers la fin des années 90 et de 2000s tôt est plus apparentée au procédé renversé, du fait elles comportent l'utilisation des fragments d'isolement d'ADN apposés à un substrat, et à l'hybridation avec une sonde faite à partir de l'ARN cellulaire. Ainsi le procédé renversé, bien qu'initialement rare, permis l'étude d'un-à-un-temps de l'expression de gène utilisant l'analyse nordique à se transformer en l'expression de gène profilant, dans laquelle plusieurs (probablement tous) des gènes dans une organization peuvent avoir leur expression surveillée

Applications de la tache nordique

Des taches nordiques ont été remplacées dans la plupart des zones par des approches en temps réel d'ACP et de microarray. Elle n'est pas employée souvent pour des buts cliniques ou diagnostiques.

Le protocole nordique de tache et ses variations sont utilisés cependant dans la recherche de biologie moléculaire :

  • un or-standard pour l'étude directe de l'expression de gène au niveau d'ADN messagère (transcriptions d'ARN de messager).
  • détection de taille de transcription d'ADN messagère
  • dégradation d'ARN d'étude
  • épissure d'ARN d'étude - peut détecter les transcriptions alternativement épissées
  • étudiez la demi vie d'ARN
  • COLÈRES d'étude (site ribosomal interne d'entrée) - pour retirer la possibilité de digestion d'ARN contre la 2ème traduction de cistron.
  • employé souvent pour confirmer et contrôler les souris transgéniques/coup de grâce (animaux)

Inconvénients du transfert de Northern

Les inconvénients d'utiliser le transfert de Northern incluent :

  • Souvent la radioactivité est utilisée. Ceci empêche la facilité de l'exécuter, disposition d'utiliser-et. De nouvelles méthodes de détection non radioactive ont été produites en permettant la détection non radioactive. Voir le Pierce.
  • Le processus entier du transfert de Northern prend un bon moment habituellement, de préparation témoin à travers à la détection.
  • Si des échantillons d'ARN même sont légèrement dégradés par RNases, la qualité des données et de la quantitation de l'expression est tout à fait négativement affectée.
  • La méthode nordique standard de tache est relativement moins sensible que des analyses de protection de nucléase et RT-PCR. La sensibilité des taches nordiques peut être augmentée avec l'utilisation des membranes positively-charged en nylon, utilisation d'une sonde antisens fortement spécifique.
  • La détection avec les sondes multiples est un problème. Souvent, les membranes doivent être éliminées avant l'hybridation et la détection avec une deuxième sonde. C'est un problème car des conditions dures sont exigées pour décoller des sondes de la tache et sont également longues. En outre, il y a une limite au nombre de heures qu'une tache peut être éliminée.

Avantages du transfert de Northern

Les avantages des taches nordiques incluent :

  • C'est une méthode largement reçue et bien considérée
  • le transfert de Northern est une méthode simple
  • Souvent il est utilisé comme confirmation ou contrôle
  • Souvent un or-standard
  • c'est un protocole souple car il peut permettre l'utilisation de beaucoup de types d'inclusion de sondes (contre l'ACP en temps réel) : ARN et même oligonucléotides transcrits radioactifs et non-radioactifs, in vitro tels que des amorces.
  • Des ordres avec même l'homologie partielle, à la différence de l'ACP en temps réel ou d'autres méthodes peuvent être utilisés comme sondes d'hybridation (c.-à-d. l'ordre de différentes espèces pour l'analyse d'homologie, ou même fragments genomic peut être utilisé).

Protocole nordique de tache

Comme mentionné les étapes dans le transfert de Northern incluent :

  1. Isolement d'ARN
  2. Électrophorèse de gel de l'ARN pour la séparation
  3. Transfert à la membrane (habituellement franchement - le nylon chargé comme ARN est négativement - chargée)
  4. Édition absolue de l'ARN à la membrane (habituellement par des moyens d'UV-réticulation ou de produit chimique)
  5. Hybridation
  6. Détection

Matériaux requis pour le protocole nordique de tache

Recettes de mémoire tampon

20XSSPE (500 ml)
  • NaCl de 3.6M : 105.2 g
  • 0. 7.0:100 ml de la solution tampon de phosphate de 2M pH de 1M
  • EDTA de 20mM : 20mL de 0.5M
Solution tampon de phosphate pH7.0 (500ml)
  • NaH2PO4 140 ml (monobasiques) de 1M
  • Na2H2PO4 360 ml (dibasiques) de 1M
  • le pH à 7.0 après tous les deux sont ajoutés
=HB de mémoire tampon d'hybridation (100mls)
  • 5X SSPE : 25mls 20X
  • 2% SDS : 20 mls 10%

 

* le *Right avant utilisation ajoutent l'ARN de la levure 5000ug d'ADN de CT de RNase dénaturé par 1000ug librement (la chaleur à 95o pour que minute 3 dénature)

 

LAVAGE : 2X SSPE + 0.1% SDS (500 mls) 50 mls des mls 20X 5 10% SDS= 0.1% SDS

Mémoire tampon courante pour le gel d'ARN (1L)
  • 100 LAVETTES des mls 10X
  • 52. 6 mls de formaldéhyde
  • 847. 4 mls H20
Gel d'ARN (70ml)
  • 0.84 agarose de g
  • 7 LAVETTES des mls 10x
  • 58.38 mls H2O
  • Mettez le gel en solution par le chauffage. Laissez le gel frais à 60°C, puis ajoutez le formaldéhyde pour égaler 0.66M --3.78 mls
  • Versez le gel dans le capot de vapeur si possible

Échantillons d'ARN pour la tache nordique

Voir l'isolement et la purification d'ARN

Gel d'ARN

Après isolement de l'ARN, l'ARN doit être séparé dehors sur un gel (habituellement agarose).

voir les gels d'ARN

Transfert nordique de tache au protocole en nylon de membrane

Après exécution du gel d'ARN, lavez le gel avec de l'eau distillée mise sur le posiblotter.

Les couches sont de haut en bas :

  • éponge
  • 3-4 coupe de papiers de Whatman à la taille (les deux vers le haut ci-dessus devraient être imbibés dans 10X SSPE mais égouttement)
  • masque de gel.
  • Note : Assurez-vous les recouvrements de gel le masque de sorte qu'il puisse sceller la membrane avec la ligne du dessus du gel et le bon coin supérieur ait marqué 3 parties de plastique dur de papier légèrement plus grand de 3M avec des trous

La bride en fonction et s'assurent qu'il y a un bon joint. Utilisez 75-80 millimètres hectogramme de pression pour 1 heure ou plus.

Épongez la membrane sèche

Membranes en nylon d'édition absolue - protocole nordique de tache

  • Coupez l'enveloppe supérieure de bon coin dans l'enveloppe de saran.
  • UV irradiez avec le côté d'ARN vers le bas pendant 2.5 mn.
  • Lavez pendant deux ou trois minutes dans la solution chaude de 2X SSPE/0.1% SDS (solution de micro-onde pendant 30-45 secondes à la puissance de 50%.
  • Aérez sec

Pré hybridation pour la tache nordique

  1. Hybridez pré pendant 6 heures-durant la nuit
  2. Placez le four à la mémoire tampon de la chaleur 65°C HB pour mettre le SDS en solution
  3. Enroulez la membrane à l'intérieur de la partie de la maille et mettez dans le tube de hybridizaton (2X SSPE/0.1%SDS)
  4. Vérifiez les bulles d'air
  5. Mettez le tube en four équilibré avec un autre tube du côté opposé

Sonde de écriture de labels pour le transfert de Northern

  1. Mettez 25ng de sonde dans un volume total de 11uL avec ddH2O
  2. Dénaturez @ 95°C 3 mn. C'est d'obtenir à la sonde échoué simple et de retirer la structure secondaire qui empêcherait l'hybridation efficace.
  3. Refroidissez vite sur la glace humide. C'est de garder le toronnage simple de sonde, exempt de la structure secondaire et de ne pas laisser reannealing (ou reformer des structures secondaires).
  4. Ajoutez (Boehringer Mannheim) 5ul l'alpha P-32 total radioactif haut principal du dCTP 4ul 3000uCi/mmole 20ul
  5. Incubez 10-15 37°C minimum
  6. Ajoutez 28uL de 1X TE, EDTA de 2ul 0.5M, à la réaction 20ul.
  7. Pré-tournez la colonne de G-25 Sephadex pour 1 minute.
  8. Ajoutez l'échantillon 50ul à la colonne et tournez pour la minute 2.5 dans la centrifugeuse clinique. C'est d'épurer la sonde à partir de l'étiquette.
  9. De lancement colonne.
  10. Mélangez dans un nouvel ARN de levure du tube 100ug CT-DNA 50ug dans un tube 0.5mL.
  11. Dénaturez la minute de 95° 3
  12. Ajoutez au mélange hybride de tube, hybridez à 65°C pendant 20-36 heures

Signalez le protocole d'hybridation pour le transfert de Northern

Hybridez pendant 36-48 heures puis de Washington.

  1. Réchauffez la chaleur de 2X SSPE/0.1% SDS (lavage) jusqu'à 65° C (micro-onde ou bain d'eau d'utilisation pour chauffer la solution)
  2. Sortez le tube et versez le liquide dans le récipient chaud de déchets radioactifs.
  3. Le rinçage avec le lavage 10ml font ceci deux fois et versent la perte dehors.
  4. Mis dans 40 à 50 mls de lavage et de secousse vigoursly.
  5. Mis en four d'hybridation pour la rotation 20 minimum.
  6. Versez en bas de l'évier
  7. Un 40-50mls et une secousse différents en four.
  8. Versez dehors dans le bac à vidange (évier sinon chaud ou toxique) et assurez-vous qu'il ne fait plus chaud et sort alors la membrane.
  9. Lavez sur le dispositif trembleur avec 0.2XSSPE avec 0.1% SDS à la droite pendant 15 mn.
  10. Aérez sec
  11. Exposition

 

Extrémités pour la tache nordique

Si vous avez actuel une méthode préférée pour isoler l'ARN, continuez à l'utiliser.

Exécutez toujours un gel d'agarose de votre ARN pour évaluer la qualité. Comptez non seulement sur des résultats de spectrophotométrie.

* Utilisez l'eau traitée par DEPC et la verrerie cuite au four. Cette solution, absolument, franchement doit être RNase librement. La RNase est partout ! Portez les gants, la verrerie cuite au four d'utilisation seulement, ou le plastique vierge. Festin de DePC votre eau, mémoires tampons (excepté Tris). Faites attention très.

 

Taches nordiques de dépannage

Si vous avez actuel une méthode préférée pour isoler l'ARN, continuez à l'utiliser.

 

Discutez et signalez les questions au sujet de ceci dans le forum nordique de tache.

Références nordiques de tache

  1. Alwine JC, Kemp DJ, GR rigide (1977). La « méthode pour la détection de RNAs spécifique dans l'agarose gélifie par transfert au diazobenzyloxymethyl-papier et l'hybridation avec de l'ADN sonde ». Proc. National. Acad. Sci. Les Etats-Unis 74 (12) : 5350-4.
  2. W. Neal Burnette (l'avril 1981). « « Éponger occidental » : transfert électrophorétique des protéines à partir de sulfate dodécylique de sodium - gels de polyacrylamide à la nitrocellulose non modifiée et détection radiographique avec de l'anticorps et la protéine radioiodinated A ». Biochimie anale 112 (2) : 195-203.