Commanditez/Annoncez & Joignez à nous & Contactez-nous & Au sujet de nous & Aidez-nous

Biologie Moléculaire Blog

Poteaux Récents de Forum

 

Tache Nordique

Copyright 2007 - Station Moléculaire

SONORE Écoutez une explication nordique détaillée de tache!

Histoire d'éponger nordique

Éponger nordique est une technique épongeante d'ARN qui a été développée en 1977 par Alwine et autres à l'université de Stanford (ref:1). Il a été baptisé du nom de la technique méridionale de tache qui éponge pour l'ADN, inventée par Edwin M. Southern en 1975. La tache occidentale, une méthode pour éponger pour des protéines est également un jeu sur la tache méridionale nommant et a été nommée en 1981 (ref:2).

Information de fond - Technique Nordique de Tache

L'analyse nordique en dépit de son âge dans le monde de technologie de pointe de PCR en temps réel, d'analyses de protection de nucléase (RPAs) et de microarrays, est toujours l'or-standard pour la détection et la quantitation des niveaux de mRNA. C'est parce que l'analyse nordique de tache permet une comparaison directe de l'abondance d'ARN de messager entre les échantillons sur une membrane simple.

Dans la tache nordique la différence principale entre les autres techniques épongeantes est que l'ARN est le facteur étant détecté. En outre, étant donné que l'ARN simple-est habituellement échoué, elle crée les structures secondaires complexes qui affectent son transfert et par conséquent dénaturant des conditions sont utilisés pour exécuter les gels (à la différence de méridional).

L'ARN est séparé dehors par l'électrophorèse de gel d'RNA (habituellement électrophorèse de gel d'agarose), le transfert ultérieur à la membrane, l'hybridation avec la sonde, et finalement la détection.

 

 

De même à éponger méridional, les sondes d'hybridation peuvent être ADN ou ARN dans éponger nordique.

Une variante du procédé connu sous le nom de tache nordique renversée de temps en temps (bien que, rarement) a été utilisée. De ce procédé, le substrat l'acide que nucléique (qu'est apposé à la membrane) est une collection de fragments d'isolement d'ADN, et la sonde est ARN extrait à partir d'un tissu et radioactivement étiqueté.

L'utilisation des microarrays d'ADN qui ont hérité l'utilisation répandue vers la fin des années 90 et de 2000s tôt est plus apparentée au procédé renversé, du fait elles comportent l'utilisation des fragments d'isolement d'ADN apposés à un substrat, et à l'hybridation avec une sonde faite à partir de l'ARN cellulaire. Ainsi le procédé renversé, bien qu'initialement rare, permis l'étude d'un-à-un-temps de l'expression de gène en utilisant l'analyse nordique pour se transformer en l'expression de gène profilant, dans laquelle plusieurs (probablement tous) des gènes dans une organization peuvent avoir leur expression surveillée

Applications de la tache nordique

Les taches nordiques ont été superceded dans la plupart des zones par PCR en temps réel et approches microarray. Elle n'est pas souvent utilisée pour des buts cliniques ou diagnostiques.

Le protocole nordique de tache et ses variations sont utilisés cependant dans la recherche moléculaire de biologie :

• un or-standard pour l'étude directe de l'expression de gène au niveau du mRNA (transcriptions d'ARN de messager).
• détection de taille de transcription de mRNA
• dégradation d'ARN d'étude
• épissure d'ARN d'étude - peut détecter les transcriptions alternativement épissées
• étudiez la demi vie d'ARN
• COLÈRES d'étude (site ribosomal interne d'entrée) - pour retirer la possibilité de digestion d'ARN contre la 2ème traduction de cistron.
• souvent pour confirmer et contrôler les souris transgéniques/coup de grâce (animaux)

Inconvénients d'éponger nordique

Les inconvénients d'utiliser éponger nordique incluent :

• Souvent la radioactivité est utilisée. Ceci empêche la facilité d'exécuter elle, l'utilisation et la disposition. De nouvelles méthodes de détection non radioactive ont été produites en permettant la détection non radioactive. Voyez Pour percer.
• Le processus entier d'éponger nordique prend un bon moment habituellement, de préparation témoin à travers à la détection.
• Si les échantillons d'ARN sont égaux légèrement dégradés par RNases, la qualité des données et de la quantitation de l'expression est tout à fait négativement affectée.
• La méthode nordique standard de tache est relativement moins sensible que des analyses de protection de nucléase et RT-PCR. La sensibilité des taches nordiques peut être augmentée avec l'utilisation des membranes positif-chargées en nylon, utilisation d'une sonde fortement spécifique d'antisense.
• La détection avec les sondes multiples est un problème. Souvent, les membranes doivent être éliminées avant l'hybridation et la détection avec une deuxième sonde. C'est un problème car des conditions dures sont exigées pour décoller des sondes de la tache et prennent également du temps. En outre, il y a une limite à la quantité de périodes que une tache peut être éliminée.

Avantages d'éponger nordique

Les avantages des taches nordiques incluent :

• C'est une méthode largement reçue et bien considérée
• éponger nordique est une méthode straight-forward
• Souvent il est utilisé comme confirmation ou contrôle
• Souvent un or-standard
• c'est un protocole souple car il peut permettre l'utilisation de beaucoup de types d'inclure de sondes (contre PCR en temps réel) : ARN et même oligonucléotides transcrits radioactifs et non-radioactifs, in vitro tels que des amorces.
• Des ordres avec même l'homologie partielle, à la différence de PCR en temps réel ou d'autres méthodes peuvent être utilisés comme sondes d'hybridation (c.-à-d. l'ordre de différentes espèces pour l'analyse d'homologie, ou même fragments genomic peut être utilisé).

Protocole Nordique de Tache

Comme mentionné les étapes dans éponger nordique incluent :

1. Isolement d'ARN
2. Électrophorèse de gel de l'ARN pour la séparation
3. Transfert à la membrane (le nylon habituellement franchement chargé comme ARN est négativement chargé)
4. Édition absolue de l'ARN à la membrane (habituellement par des moyens d'UV-RÉTICULATION ou de produit chimique)
5. Hybridation
6. Détection

Matériaux requis pour le protocole nordique de tache

Recettes de Mémoire tampon

20XSSPE (500 ml)

• NaCl de 3.6M : 105.2 g
• 0. solution tampon de phosphate de 2M pH 7.0 : 100mL de 1M
• EDTA de 20mM : 20mL de 0.5M

Solution tampon de phosphate pH7.0 (500ml)

• NaH2PO4 140 ml (monobasiques) de 1M
• Na2H2PO4 360 ml (dibasiques) de 1M
• le pH à 7.0 après tous les deux sont ajoutés

Mémoire tampon d'hybridation = HB (100mls)

• 5X SSPE : 25mls 20X
• 2% SDS : 20 mls 10%

 

* * Droit avant utilisation ajoutez l'ARN de la levure 5000ug d'ADN de la RNase dénaturé par 1000ug librement CT (la chaleur à 95o pendant 3 minutes à dénaturer)

 

LAVAGE : 2X SSPE + 0.1% SDS (500 mls) 50 mls des mls 20X 5 10% SDS = 0.1% SDS

Mémoire tampon courante pour le gel d'ARN (1L)

• 100 LAVETTES des mls 10X
• 52. 6 mls de formaldéhyde
• 847. 4 mls H20

Gel d'ARN (70ml)

• 0.84 agarose de g
• 7 LAVETTES des mls 10x
• 58.38 mls H2O
• Mettez le gel en solution par le chauffage. Laissez le gel frais à 60°C, puis ajoutez le formaldéhyde à l'égale 0.66M -- 3.78 mls
• Versez le gel dans le capot de vapeur si possible

Échantillons d'ARN pour la tache nordique

Voir l'isolement et la purification d'ARN

Gel d'ARN

Après isolement de l'ARN, l'ARN doit être séparé dehors sur un gel (habituellement agarose).

voir les gels d'ARN

Transfert nordique de tache au protocole en nylon de membrane

Après exécution du gel d'ARN, lavez le gel avec de l'eau distillée mise sur le posiblotter.

Les couches de haut en bas sont :

• éponge
• 3-4 coupe de papiers de Whatman à la taille (tous les deux ci-dessus hauts devraient être imbibés dans 10X SSPE mais égouttement)
• masque de gel.
• Note : S'assurent les recouvrements de gel le masque de sorte qu'il puisse sceller la membrane avec la ligne du dessus du gel et le bon coin supérieur ait marqué 3 morceaux de plastique dur 3M de papier légèrement plus grand avec des trous

La bride en fonction et s'assurent qu'il y a un bon joint. Utilisez 75-80 millimètres hectogramme de pression pour 1 heure ou plus.

Épongez la membrane sèche

Membranes En nylon d'Édition absolue - Protocole Nordique de Tache

• Coupez l'enveloppe supérieure de bon coin dans l'enveloppe de saran.
• UV irradiez avec le côté d'ARN vers le bas pendant 2.5 minutes.
• Lavez pour un couple des minutes dans la solution chaude de 2X SSPE/0.1% SDS (solution de micro-onde pendant 30-45 secondes à la puissance de 50%.
• Aérez sec

Pré hybridation pour la tache nordique

1. Hybridez pré pendant 6 heures-durant la nuit
2. Placez le four à la mémoire tampon de la chaleur 65°C HB pour mettre le SDS en solution
3. Enroulez la membrane à l'intérieur du morceau de maille et mettez dans le hybridizaton tube(2X SSPE/0.1%SDS)
4. Vérifiez les bulles d'air
5. Mettez le tube en four équilibré avec un autre tube du côté opposé

Sonde étiquetante pour éponger nordique

1. Mettez 25ng de sonde dans un volume total de 11uL avec ddH2O
2. Dénaturez @ 95°C 3 minutes. Ce doit obtenir à la sonde échoué simple et retirer la structure secondaire qui empêcherait l'hybridation efficace.
3. Refroidissez vite sur la glace humide. Ce doit garder échoué simple de sonde, exempt de la structure secondaire et ne pas laisser reannealing (ou reformer des structures secondaires).
4. Ajoutez le total radioactif (Boehringer Mannheim) 5ul de l'alpha haut principal 4ul P-32 dCTP 3000uCi/mmole 20ul
5. Incubez 10-15 37°C minimum
6. Ajoutez 28uL du 1X TE, EDTA de 2ul 0.5M, à la réaction 20ul.
7. Pré-tournez la colonne de G-25 Sephadex pour 1 minute.
8. Ajoutez l'échantillon 50ul à la colonne et tournez pendant 2.5 minutes dans la centrifugeuse clinique. Ce doit épurer la sonde loin de l'étiquette.
9. De jet colonne loin.
10. Mélangez dans un nouvel ARN de levure du tube 100ug CT-DNA 50ug dans un tube 0.5mL.
11. Dénaturez 95° 3 minutes
12. Ajoutez au mélange hybride de tube, hybridez à 65°C pendant 20-36 heures

Signalez le protocole d'hybridation pour éponger nordique

Hybridez pendant 36-48 heures lavent alors.

1. Réchauffez la chaleur de 2X SSPE/0.1% SDS (lavage) jusqu'à 65° C (micro-onde ou bain d'eau d'utilisation pour chauffer la solution)
2. Sortez le tube et versez le liquide dans le récipient chaud de déchets radioactifs.
3. Le rinçage avec le lavage 10ml font ceci deux fois et versent la perte dehors.
4. Mis dans 40 à 50 mls de lavage et de secousse vigoursly.
5. Mis en four d'hybridation pour la rotation 20 minimum.
6. Versez en bas de l'évier
7. Un 40-50mls et une secousse différents en four.
8. Versez dehors dans le bac à vidange (évier si non chaud ou toxique) et assurez-vous qu'il ne fait plus chaud et sort alors la membrane.
9. Lavez sur le dispositif trembleur avec 0.2XSSPE avec 0.1% SDS à la droite pendant 15 minutes.
10. Aérez sec
11. Exposition

 

Extrémités pour la tache nordique

Si vous avez actuel une méthode préférée pour isoler l'ARN, continuez à l'utiliser.

Exécutez toujours un gel d'agarose de votre ARN pour évaluer la qualité. Comptez non seulement sur des résultats de spectrophotométrie.

* Utilisez l'eau traitée par DEPC et la verrerie cuite au four. Cette solution, absolument, franchement doit être RNase librement. La RNase est partout ! Portez les gants, la verrerie cuite au four d'utilisation seulement, ou le plastique vierge. Festin de DePC votre eau, mémoires tampons (excepté Tris). Faites attention très.

 

Taches Nordiques de Dépannage

Si vous avez actuel une méthode préférée pour isoler l'ARN, continuez à l'utiliser.

 

Discutez et signalez les questions à ce sujet dans le forum nordique de tache.

Références Nordiques de Tache

1. Alwine JC, Kemp DJ, GR Rigide (1977). la "méthode pour la détection de RNAs spécifique dans l'agarose gélifie par transfert au diazobenzyloxymethyl-papier et l'hybridation avec de l'ADN sonde". Proc. National. Acad. Sci. LES Etats-Unis. 74 (12) : 5350-4.
2. W. Neal Burnette (Avril 1981). "'éponger occidental ': le transfert électrophorétique des protéines à partir des gels de polyacrylamide de sulfate — dodécylique de sodium à la nitrocellulose non modifiée et de la détection radiographique avec de l'anticorps et radioiodinated la protéine A ". Biochimie Anale 112 (2) : 195-203.