Tache Nordique
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Écoutez une explication nordique détaillée de tache!
Histoire d'éponger nordique
Éponger nordique est une technique épongeante
d'ARN qui a été développée en 1977 par Alwine et autres à
l'université de Stanford (ref:1). Il a été baptisé du nom de la technique méridionale de tache qui éponge pour l'ADN, inventée par Edwin
M. Southern en 1975. La tache occidentale, une méthode pour éponger pour des protéines est
également un jeu sur la tache méridionale nommant et a été nommée
en 1981 (ref:2).
Information de fond - Technique Nordique de Tache
L'analyse nordique en dépit de son âge dans le
monde de technologie de pointe de PCR en temps réel, d'analyses de
protection de nucléase (RPAs) et de microarrays, est toujours
l'or-standard pour la détection et la quantitation des niveaux de
mRNA. C'est parce que l'analyse nordique de tache permet une
comparaison directe de l'abondance d'ARN de messager entre les
échantillons sur une membrane simple.
Dans la tache nordique la différence principale entre les
autres techniques épongeantes est que l'ARN est le facteur étant
détecté. En outre, étant donné que l'ARN simple-est
habituellement échoué, elle crée les structures secondaires
complexes qui affectent son transfert et par conséquent dénaturant
des conditions sont utilisés pour exécuter les gels (à la
différence de méridional).
L'ARN est séparé dehors par l'électrophorèse de gel d'RNA (habituellement électrophorèse de gel d'agarose), le
transfert ultérieur à la membrane, l'hybridation avec la sonde, et
finalement la détection.

De même à éponger méridional, les sondes
d'hybridation peuvent être ADN ou ARN dans éponger nordique.
Une variante du procédé connu sous le nom de tache
nordique renversée de temps en temps (bien que, rarement) a été
utilisée. De ce procédé, le substrat l'acide que nucléique
(qu'est apposé à la membrane) est une collection de fragments
d'isolement d'ADN, et la sonde est ARN extrait à partir d'un tissu et
radioactivement étiqueté.
L'utilisation des microarrays d'ADN qui ont hérité
l'utilisation répandue vers la fin des années 90 et de 2000s tôt
est plus apparentée au procédé renversé, du fait elles comportent
l'utilisation des fragments d'isolement d'ADN apposés à un substrat,
et à l'hybridation avec une sonde faite à partir de l'ARN
cellulaire. Ainsi le procédé renversé, bien qu'initialement
rare, permis l'étude d'un-à-un-temps de l'expression de gène en
utilisant l'analyse nordique pour se transformer en l'expression de
gène profilant, dans laquelle plusieurs (probablement tous) des
gènes dans une organization peuvent avoir leur expression
surveillée
Applications de la tache nordique
Les taches nordiques ont été superceded dans la
plupart des zones par PCR en temps réel et approches microarray.
Elle n'est pas souvent utilisée pour des buts cliniques ou
diagnostiques.
Le protocole nordique de tache et ses variations sont
utilisés cependant dans la recherche moléculaire de biologie :
- un or-standard pour l'étude directe de l'expression de
gène au niveau du mRNA (transcriptions d'ARN de messager).
- détection de taille de transcription de mRNA
- dégradation d'ARN d'étude
- épissure d'ARN d'étude - peut détecter les
transcriptions alternativement épissées
- étudiez la demi vie d'ARN
- COLÈRES d'étude (site ribosomal interne
d'entrée) - pour retirer la possibilité de digestion d'ARN contre la
2ème traduction de cistron.
- souvent pour confirmer et contrôler les souris
transgéniques/coup de grâce (animaux)
Inconvénients d'éponger nordique
Les inconvénients d'utiliser éponger nordique
incluent :
- Souvent la radioactivité est utilisée. Ceci
empêche la facilité d'exécuter elle, l'utilisation et la
disposition. De nouvelles méthodes de détection non
radioactive ont été produites en permettant la détection non
radioactive. Voyez Pour percer.
- Le processus entier d'éponger nordique prend un bon
moment habituellement, de préparation témoin à travers à la
détection.
- Si les échantillons d'ARN sont égaux légèrement
dégradés par RNases, la qualité des données et de la quantitation
de l'expression est tout à fait négativement affectée.
- La méthode nordique standard de tache est relativement
moins sensible que des analyses de protection de nucléase et RT-PCR.
La sensibilité des taches nordiques peut être augmentée avec
l'utilisation des membranes positif-chargées en nylon, utilisation
d'une sonde fortement spécifique d'antisense.
- La détection avec les sondes multiples est un problème.
Souvent, les membranes doivent être éliminées avant
l'hybridation et la détection avec une deuxième sonde. C'est
un problème car des conditions dures sont exigées pour décoller des
sondes de la tache et prennent également du temps. En outre, il
y a une limite à la quantité de périodes que une tache peut être
éliminée.
Avantages d'éponger nordique
Les avantages des taches nordiques incluent :
- C'est une méthode largement reçue et bien considérée
- éponger nordique est une méthode
straight-forward
- Souvent il est utilisé comme confirmation ou
contrôle
- Souvent un or-standard
- c'est un protocole souple car il peut permettre
l'utilisation de beaucoup de types d'inclure de sondes (contre PCR en
temps réel) : ARN et même oligonucléotides transcrits
radioactifs et non-radioactifs, in vitro tels que des amorces.
- Des ordres avec même l'homologie partielle, à la
différence de PCR en temps réel ou d'autres méthodes peuvent être
utilisés comme sondes d'hybridation (c.-à-d. l'ordre de différentes
espèces pour l'analyse d'homologie, ou même fragments genomic
peut être utilisé).
Protocole Nordique de Tache
Comme mentionné les étapes dans éponger
nordique incluent :
- Isolement d'ARN
- Électrophorèse de gel de l'ARN pour la
séparation
- Transfert à la membrane (le nylon habituellement
franchement chargé comme ARN est négativement chargé)
- Édition absolue de l'ARN à la membrane
(habituellement par des moyens d'UV-RÉTICULATION ou de produit
chimique)
- Hybridation
- Détection
Matériaux requis pour le protocole nordique de
tache
Recettes de Mémoire tampon
20XSSPE (500 ml)
- NaCl de 3.6M : 105.2 g
- 0. solution tampon de phosphate de 2M pH
7.0 : 100mL de 1M
- EDTA de 20mM : 20mL de 0.5M
Solution tampon de phosphate pH7.0 (500ml)
- NaH2PO4 140 ml (monobasiques) de 1M
- Na2H2PO4 360 ml (dibasiques) de 1M
- le pH à 7.0 après tous les deux sont ajoutés
Mémoire tampon d'hybridation = HB
(100mls)
- 5X SSPE : 25mls 20X
- 2% SDS : 20 mls 10%
* * Droit avant utilisation ajoutez l'ARN
de la levure 5000ug d'ADN de la RNase dénaturé par 1000ug librement
CT (la chaleur à 95o pendant 3 minutes à dénaturer)
LAVAGE : 2X SSPE + 0.1% SDS (500 mls) 50
mls des mls 20X 5 10% SDS = 0.1% SDS
Mémoire tampon courante pour le gel d'ARN (1L)
- 100 LAVETTES des mls 10X
- 52. 6 mls de formaldéhyde
- 847. 4 mls H20
Gel d'ARN (70ml)
- 0.84 agarose de g
- 7 LAVETTES des mls 10x
- 58.38 mls H2O
- Mettez le gel en solution par le chauffage.
Laissez le gel frais à 60°C, puis ajoutez le formaldéhyde à
l'égale 0.66M -- 3.78 mls
- Versez le gel dans le capot de vapeur si
possible
Échantillons d'ARN pour la tache nordique
Voir l'isolement et la
purification d'ARN
Gel d'ARN
Après isolement de l'ARN, l'ARN doit être
séparé dehors sur un gel (habituellement agarose).
voir les gels d'ARN
Transfert nordique de tache au protocole en nylon
de membrane
Après exécution du gel
d'ARN, lavez le gel avec de l'eau distillée mise
sur le posiblotter.
Les couches de haut en bas sont :
- éponge
- 3-4 coupe de papiers de Whatman à la taille
(tous les deux ci-dessus hauts devraient être imbibés dans 10X SSPE
mais égouttement)
- masque de gel.
- Note : S'assurent les recouvrements de gel le masque
de sorte qu'il puisse sceller la membrane avec la ligne du dessus du
gel et le bon coin supérieur ait marqué 3 morceaux de plastique dur
3M de papier légèrement plus grand avec des trous
La bride en fonction et s'assurent qu'il y a un
bon joint. Utilisez 75-80 millimètres hectogramme de pression
pour 1 heure ou plus.
Épongez la membrane sèche
Membranes En nylon d'Édition absolue - Protocole
Nordique de Tache
- Coupez l'enveloppe supérieure de bon coin dans
l'enveloppe de saran.
- UV irradiez avec le côté d'ARN vers le bas pendant 2.5
minutes.
- Lavez pour un couple des minutes dans la solution chaude
de 2X SSPE/0.1% SDS (solution de micro-onde pendant 30-45 secondes à
la puissance de 50%.
- Aérez sec
Pré hybridation pour la tache nordique
- Hybridez pré pendant 6 heures-durant la nuit
- Placez le four à la mémoire tampon de la
chaleur 65°C HB pour mettre le SDS en solution
- Enroulez la membrane à l'intérieur du morceau
de maille et mettez dans le hybridizaton tube(2X SSPE/0.1%SDS)
- Vérifiez les bulles d'air
- Mettez le tube en four équilibré avec un autre
tube du côté opposé
Sonde étiquetante pour éponger nordique
- Mettez 25ng de sonde dans un volume total de 11uL
avec ddH2O
- Dénaturez @ 95°C 3 minutes. Ce doit
obtenir à la sonde échoué simple et retirer la structure secondaire
qui empêcherait l'hybridation efficace.
- Refroidissez vite sur la glace humide. Ce doit
garder échoué simple de sonde, exempt de la structure secondaire et
ne pas laisser reannealing (ou reformer des structures secondaires).
- Ajoutez le total radioactif (Boehringer Mannheim) 5ul de
l'alpha haut principal 4ul P-32 dCTP 3000uCi/mmole 20ul
- Incubez 10-15 37°C minimum
- Ajoutez 28uL du 1X TE, EDTA de 2ul 0.5M, à la
réaction 20ul.
- Pré-tournez la colonne de G-25 Sephadex pour 1 minute.
- Ajoutez l'échantillon 50ul à la colonne et tournez
pendant 2.5 minutes dans la centrifugeuse clinique. Ce doit
épurer la sonde loin de l'étiquette.
- De jet colonne loin.
- Mélangez dans un nouvel ARN de levure du tube 100ug
CT-DNA 50ug dans un tube 0.5mL.
- Dénaturez 95° 3 minutes
- Ajoutez au mélange hybride de tube, hybridez à
65°C pendant 20-36 heures
Signalez le protocole d'hybridation pour éponger
nordique
Hybridez pendant 36-48 heures lavent alors.
- Réchauffez la chaleur de 2X SSPE/0.1% SDS (lavage)
jusqu'à 65° C (micro-onde ou bain d'eau d'utilisation pour chauffer
la solution)
- Sortez le tube et versez le liquide dans le
récipient chaud de déchets radioactifs.
- Le rinçage avec le lavage 10ml font ceci deux fois et
versent la perte dehors.
- Mis dans 40 à 50 mls de lavage et de secousse vigoursly.
- Mis en four d'hybridation pour la rotation 20 minimum.
- Versez en bas de l'évier
- Un 40-50mls et une secousse différents en four.
- Versez dehors dans le bac à vidange (évier si non chaud
ou toxique) et assurez-vous qu'il ne fait plus chaud et sort alors la
membrane.
- Lavez sur le dispositif trembleur avec 0.2XSSPE avec 0.1%
SDS à la droite pendant 15 minutes.
- Aérez sec
- Exposition
Extrémités pour la tache nordique
Si vous avez actuel une méthode préférée pour
isoler l'ARN, continuez à l'utiliser.
Exécutez toujours un gel d'agarose de votre ARN pour
évaluer la qualité. Comptez non seulement sur des résultats
de spectrophotométrie.
* Utilisez l'eau traitée par DEPC et la verrerie
cuite au four. Cette solution, absolument, franchement doit
être RNase librement. La RNase est partout ! Portez les
gants, la verrerie cuite au four d'utilisation seulement, ou le
plastique vierge. Festin de DePC votre eau, mémoires tampons
(excepté Tris). Faites attention très.
Taches Nordiques de Dépannage
Si vous avez actuel une méthode préférée pour
isoler l'ARN, continuez à l'utiliser.
Discutez et signalez les questions à ce sujet dans le forum nordique de tache.
Références Nordiques de Tache
- Alwine JC, Kemp DJ, GR Rigide (1977). la
"méthode pour la détection de RNAs spécifique dans l'agarose
gélifie par transfert au diazobenzyloxymethyl-papier et l'hybridation
avec de l'ADN sonde". Proc. National. Acad.
Sci. LES Etats-Unis. 74 (12) : 5350-4.
- W. Neal Burnette (Avril 1981). "'éponger occidental
': le transfert électrophorétique des protéines à partir des
gels de polyacrylamide de sulfate — dodécylique de sodium
à la nitrocellulose non modifiée et de la détection radiographique
avec de l'anticorps et radioiodinated la protéine A ".
Biochimie Anale 112 (2) : 195-203.