ACP en temps réel

L'ACP en temps réel est un type de l'ACP quantitatif qui mesure la quantité de cDNA ou d'ADN messagère dans un échantillon, provenant d'une population des cellules (culture de tissu ou de cellules), ou récemment même d'une cellule. Le temps réel est employé généralement pour déterminer l'expression de l'ADN messagère d'un gène, et son expression nivelle (nombre de copie d'ADN messagère) pendant certains états (tels que traiter des cellules avec une drogue).  L'ACP en temps réel peut être employé pour comparer les échantillons normaux (de commande) aux échantillons de la maladie, donnant une idée quant aux modifications d'expression qui se produisent avec la pathogénie.  L'ACP en temps réel dû à sa sensibilité est également utilisé dans la détection des microbes pathogènes dans le sang tel que des virus.

Le développement de l'ACP quantitatif en temps réel a éliminé la variabilité traditionnellement liée à l'ACP quantitatif, de ce fait laisser
quantitation courante et fiable des produits d'ACP.

Table des matières

Chaque type expressess de cellules un ensemble de molécules d'ADN messagère, connu sous le nom de transcriptome.  En réponse aux stimulus, les cellules peuvent vers le haut-régler ou vers le bas-régler des facteurs tels que des enzymes de protéine à l'intérieur de la cellule en réglant les niveaux d'ADN messagère de ces facteurs.  des niveaux d'ADN messagère ne sont pas toujours corrélés avec des niveaux de protéine ainsi une certaine attention est nécessaire, toutefois généralement les niveaux d'ADN messagère correspondent lâchement aux niveaux de protéine.  La mesure des niveaux d'ADN messagère de certains facteurs à l'intérieur d'une cellule utilisant l'ACP en temps réel est une méthode qui donnera des indices quant aux quantités de ces facteurs ou protéines.

Traditionnellement, des niveaux d'ADN messagère à l'intérieur de la cellule ont été mesurés utilisant le transfert de Northern.  Cette technique est considérée comme un or-standard dans la mesure des niveaux de l'expression de gène/ADN messagère pendant qu'elle emploie la sonde radioactive pour étiqueter l'ARN, qui est alors mesuré utilisant un compteur à scintillation donnant les lectures très précises. Le transfert de Northern bien que très précis a eu plusieurs inconvénients comprenant l'utilisation de la radioactivité. Le transfert de Northern a exigé la mesure précise de l'ADN messagère et l'ARN total des cellules a extrait afin de comparer des échantillons. C'était un problème parce que bien que les méthodes de détection aient été très précises, l'erreur pourrait être introduite dans le transfert de Northern (ou le point d'ARN/fente épongeant) par des différences dans les niveaux totaux de RNA/mRNA entre les échantillons (traitements de cellules d'IE, différents tissus, différents animaux, etc.).  Il également a exigé relativement les grands nombres d'ARN qui ont exigé un grand nombre de cellules. Récemment, la quantification de gène d'ADN messagère ou les méthodes en temps réel d'ACP ont été améliorées et sont plus faciles à exécuter et n'exigent pas l'utilisation de la radioactivité.  Les chercheurs ont souvent seulement accès à un peu de cellules particulièrement dans les domaines de la recherche de cellules de tige et de la recherche de cellules primaires, et l'ACP en temps réel a permis pour mesurer des niveaux d'ADN messagère même très d'un nombre restreint de cellules et récemment même de cellules.  Cependant, cette sensibilité extrême des méthodes en temps réel d'ACP le rend essentiel de protéger à un échantillons contre la contamination, qui mènerait aux résultats faux. Les méthodes actuelles et les systèmes d'ACP de temps réel également n'exigent pas la mesure des concentrations d'échantillon d'ADN messagère ou de cDNA avant que l'ACP en temps réel soit conduit.

Higuchi et al.1, 2 ont frayé un chemin l'analyse de la cinétique d'ACP en construisant un système qui détecte des produits d'ACP As
ils s'accumulent. Ce système « en temps réel » inclut le bromure d'éthidium d'intercalator dans chaque réaction d'amplification,
un cycler thermique adapté pour irradier les échantillons avec la lumière UV, et détection de la fluorescence en résultant
avec un appareil-photo refroidi commandé par ordinateur de CCD. L'amplification produit des quantités croissantes de bicaténaire
ADN, qui lie le bromure d'éthidium, ayant pour résultat une augmentation de la fluorescence. En traçant l'augmentation de la fluorescence
contre le nombre de cycle, le système produit les traçages d'amplification qui fournissent une image plus complète de
L'ACP traitent que l'accumulation de analyse de produit après un nombre fixe de cycles.