Protocoles stables de transfection

L'AFCS utilise la technologie antisens pour manipuler l'expression de protéine de signalisation dans les 264.7 CRUS macrophage-comme la variété de cellule. Ceci peut être réalisé par la transfection des oligonucléotides antisens gène-spécifiques (ASOs). Le procédé suivant implique la transfection d'ASOs dans les 264.7 cellules CRUES utilisant le réactif de transfection de FuGENE 6. Ultérieurement, le tout le ARN ou protéine d'isolement de ces cellules transfected peut être employé pour évaluer le niveau de la précipitation d'ADN messagère ou de protéine, respectivement. - [Transfection antisens lue d'oligonucléotide des 264.7 cellules CRUES avec FuGENE 6 dans un paraboloïde 24-Well]

Des champs électriques pulsés peuvent être employés pour introduire l'ADN dans une large variété de cellules animales. L'électroporation fonctionne bien avec les variétés de cellule qui sont réfringentes à d'autres techniques, telles que le coprecipitation de phosphate-ADN de calcium. Mais, comme avec d'autres méthodes de transfection, les conditions optimales pour electroporating l'ADN dans des variétés de cellule non essayées doivent être déterminées expérimentalement. - [Transfection lue d'ADN par Electroporation]

Les cellules de CHO Lec 3.2.8.1 ont 4 mutations indépendantes des voies dans de N et d'O glycosylation. Une fois cultivées avec l'inhibiteur de l'alpha-glucosidase I N-butylique-deoxynojirimycin, les glycoprotéines produites en cellules de CHO Lec 3.2.8.1 sont complètement susceptibles de la digestion Endo de H. H Endo fend le chitobiose, laissant un N-acetylglucosamine N-joint simple par site qui est idéal pour la maintenance de la solubilité des protéines et des interactions spéciales de carburateur-protéine, comme entre le premiers résidu et tryp de glucosamine de N-acétyle. - [Établissement lu de Transfectant stable de protocole de cellules de CHO Lec]

Des cellules stablement transfected, produites dans les deux premières étapes du procédé, sont induites pour l'expression du gène de cible. Après moisson et lysis, les lysates sont analysés par SDS-PAGE et immunoblotting. - [Tétracycline lue comme régulateur d'expression de gène induisible III]

Le protocole utilise un système autoregulatory dans lequel le tTA transcriptional de transport-activateur pilote sa propre expression et cela d'un gène de cible. La première phase du procédé décrit comment produire des lignes stables des cellules NIH-3T3 qui expriment le tTA ou le tTA et seul le gène tétracycline-réglé de cible. - [Tétracycline lue comme régulateur de protocole induisible d'expression de gène]

Cette étape du procédé décrit la transfection avec des gènes de cible des variétés de cellule exprimant déjà le tTA induisible. Dans cet exemple, les gènes de cible transfected sur un plasmide qui porte la résistance de puromycin comme repère sélectionnable. - [Tétracycline lue comme régulateur de protocole induisible II d'expression de gène]