Protocole de polymérisation de Tubulin en utilisant GTP et GMPCPP

Protocole de polymérisation de Tubulin en utilisant GTP et GMPCPP

Formation de graine de A. GMPCPP (voir l'extrémité # 1)

1. Pour former les graines courtes de GMPCPP, mélangez Tubulin non étiqueté et finale de mg/ml de Tubulin (1 à 3) étiquetée à un taux approprié dans le 1X BRB80 à 1 millimètre DTT et 0.5 à 1 millimètre GMPCPP sur la glace.
2. Incubez à 0°C pendant 5 à 10 minutes.
3. Clarifiez en centrifugeant le mélange pendant 5 minutes dans le rotor TLA100 à 90.000 t/mn (360.000 X g) à 2°C.
4. Gelez le surnageant (CPP Tubulin) en 5 à 10 μl parties aliquotes en azote liquide et l'enregistrez à -80°C.
5. Transférez un tube de CPP Tubulin à partir du congélateur à un bain 37°C.
6. Incubez pendant 15 à 20 minutes à 37°C.
7. Diluez à 150 à 200 μl avec BRB80 chaud avec 1 millimètre DTT.
8. Centrifugez les graines dans un rotor TLA100 à 90.000 t/mn (360.000 X g) pendant 5 minutes à 25 à 30°C.
9. Jetez le surnageant et resuspendez le granule dans 1 à 2 volumes de BRB80 avec 1 millimètre DTT. Ce processus retire CPP libre et unpolymerized Tubulin.

B. Clarification de Tubulin préparé

1. Mélange Tubulin non étiqueté et Tubulin étiqueté à une finale de mg/ml du taux (1 à 3) appropriée dans le 1X BRB80 avec 1 millimètre DTT et 1 millimètre GTP sur la glace (voir les extrémités #2 et # 3).
2. Incubez pendant 5 minutes à 0°C.
3. Centrifugez le mélange pour 5 minimum à l'aide d'un rotor TLA100 à 90.000 t/mn (360.000 X g) à 2°C.

C. Polymérisation de Tubulin

1. Rassemblez le surnageant de l'étape # du B3 et incubez à 37°C pendant 1 minute.
2. Ajoutez un petit volume des graines de GMPCPP faites dans la section volume de A (approximativement 0.05 à 0.02) après que le mélange de polymérisation ait été à 37°C pendant 1 minute (voir l'extrémité # 4). Axonemes ou centosomes peut être utilisé en tant que structures nucleating.
3. Continuez l'incubation à 37°C. Si la concentration de Tubulin est 2 mg/ml ou plus haut, l'assemblage procédera rapidement à l'état d'équilibre (approximativement 30 minutes). Si la concentration est moins de 2 mg/ml, la nucléation peut limiter et il est difficile prévoir la cinétique précise de l'approche à l'état d'équilibre. Dans ce cas-ci, elle dépendra de la quantité de Tubulin actif dans le mélange (voir l'extrémité # 5)

Mémoires tampons de Polymérisation de Tubulin

1 millimètre DTT Solution BRB80 (1X)    (généralement gardé comme des actions 5X et enregistré à 4°C) PIPES de 80 millimètres 1 millimètre EGTA 1 millimètre MgCl2 pH 6.8 100 millimètres GMPCPP 100 millimètres GTP

Matériaux

Extrémités pour le protocole