Protocole de transfection de cellules de drosophile

Protocole de transfection de cellules de drosophile

Culture de tissu de drosophile - protocole de transfection de cellules

1. Graine 5 ml de support dans un paraboloïde de 60 millimètres avec 0.2 à 0.3 ml de cellules de la culture de cellules (5 à 8 x 106, c.-à-d. 2 à 3 un jour - vieille culture).
2. Incubez à 25°C pour au moins 6 heures ou durant la nuit avant transfection.
3. Le μg du mélange 10 de l'ADN de plasmide avec 0.4 ml de CaCl2 de 0.25 M et ajoutent à 0.4 ml de 2X HEBS, pH 7.1 goutte-à-goutte avec le tourbillonnement dans un tube à essai de polycarbonate de 17 x 100 millimètres.
4. Incubez à la température ambiante pour la minute 20 à 30, la solution devrait devenir légèrement nuageux.
5. Ajoutez 0.8 ml du précipité d'ADN au paraboloïde de 60 millimètres et tourbillonnez. Incubez à 25°C.
6. Pour la sélection (c.-à-d. pour des variétés de cellule transformées) après 24 heures, coupez le 1:4 de cellules en nouveau support. Après encore 24 heures, ajoutez la drogue sélective appropriée pour le plasmide utilisé (par exemple, G-418 à 1 mg/ml ou hygromycin à 200 μg/ml).
7. Coupez les cellules tous les 7 à 10 jours en support (drogue-contenant) sélectif.
8. Élevez les variétés de cellule comme cultures mixtes dans le support sélectif.

Mémoires tampons de transfection de drosophile

0.25 CaCl2 de M
HEBS (2X)		42 millimètres HEPES (acide libre) 2.8 millimètres de phosphate de sodium dibasique (Na2HPO4) Filtre et mémoire stériles à -20°C 274 millimètres de NaCl En dégelant pour une transfection, le pH à 7.1 de nouveau, et le filtre stérile avant emploi. pH à 7.1 avec du NaOH 9.4 millimètres de KCl

Les matériaux ont eu besoin pour la transfection de drosophile

• Phosphate de sodium, dibasique
• Chlorure de calcium
• Hydroxyde de sodium
• G-418
• HEPES, acide libre
• Chlorure de potassium
• Chlorure de sodium
• Hygromycin