Bioinformatics, Protocoles, Protéine Proteomics d'ARN d'ADN
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La nature en compose de ses plus belles poésies pour le microscope et le télescope. ~Theodore Roszak, où la terre en friche Ends, 1972
Détails d'Article
Étiqueter d'ADN de Genomic du protocole de Microarrays |
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| Date Ajoutée : 02 mars 2008 08:15:14 P.M. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Auteur : | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Catégorie : Protocoles d'ADN Microarray | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Ce protocole a été développé pour l'hybridation
genomic comparative microarray-basée.ADN de Genomic étiquetant pour le protocole pas à pas détaillé de Microarrays1. Additionnez 2 μg de l'échantillon genomic d'ADN à étiqueter à un tube frais de microcentrifuge (voir le conseil # 1). 2. Ajoutez TE ou ddH2O à un volume total de 21 μl. 3. Ajoutez 20 μl de mélange de la réaction 2.5X. 4. Bouillez la réaction d'échantillon pendant 5 minutes. 5. Laissez la réaction fraîche sur la glace. 6. Ajoutez 5 μl de mélange du dNTP 10X à la réaction sur la glace. 7. Ajoutez 3 μl de Cy5-dCTP ou de Cy3-dCTP (voir le conseil # 2) à la réaction. 8. Ajoutez 1 μl de fragment de Klenow (voir le conseil # 3) à la réaction. 9. Incubez la réaction au °C 37 pour 1 à 2 heures. 10. Arrêtez la réaction en ajoutant 5 μl d'EDTA de 0.5 M. 11. Ajoutez 450 μl de TE à la réaction. 12. Placez le mélange de réaction sur un filtre de Microcon™ 30. 13. Centrifugez à 10.000 X g dans un microcentrifuge pendant 10 minutes. 14. Inversez l'unité dans un tube et une centrifugeuse frais à 8.000 pendant 1 minute. L'éluat devrait être approximativement 20 à 40 μl. 15. Pour deux hybridations d'alignement de couleur, combinez le Cy5- épuré et Cy3-labeled sonde dans un tube frais de microcentrifuge. 16. Ajoutez ce qui suit : 30 à 50 μg d'ADN Cot-1 humaine (voir le conseil # 4) 100 μg de tRNA de levure (voir le conseil # 5) 20 μg de poly(dA)-poly(dT) (voir le conseil # 6) 450 μl de TE 7.4 17. Concentrez la réaction à un filtre de Microcon™ 30 comme précédemment décrit. Contrôlez le volume chaque minute jusqu'à ce que le volume soit de 12 μl ou moins. 18. Ajustez le volume du mélange de sonde sur 12 μl avec ddH2O. 19. Additionnez 2.55 μl de 20X SSC (pour une concentration finale de 3.4X) et 0.45 μl de 10% SDS (pour une concentration finale de 0.3%). Tout le volume devrait être de 15 μl, qui est approprié pour l'hybridation sous des 22 millimètres X glissade de couverture de 22 millimètres (voir le conseil # 7). 20. Dénaturez le mélange d'hybridation en le chauffant à 100°C pendant 1.5 minute. 21. Incubez le mélange pendant 30 minutes à 37°C. 22. Appliquez-vous à l'alignement. 23. Hybridez le microarray à 65°C durant la nuit (pour 16 à 20 heures). 24 Lavez les alignements comme suit : Lavage 1 : 2X SSC/0.3% SDS pendant 5 minutes à 65°C Lavage 2 : 1X SSC pendant 5 minutes à la température ambiante Lavage 3 : 0.2X SSC pendant 5 minutes à la température ambiante 25. Balayez l'alignement. Mémoires tampons pour étiqueter d'ADN de Genomic de Microarrays
Les matériaux ont eu besoin pour étiqueter de MicroarrayTris Chlorure de Magnésium SDS Poly(dA)-poly(dT) TRNA de levure ADN Cot-1 Humaine dCTP Filtre de Microcon™ 30 dTTP Cy3-dCTP dGTP dATP Cy5-dCTP octamers aléatoires EDTA Klenow Citrate sodique 2-Mercaptoethanol Notes de Protocole :1. Pour la haut-complexité DNAs (par exemple, ADN genomic humaine), la réaction étiquetante fonctionne plus efficacement si la taille de fragment de l'ADN est d'abord réduite par digestion d'enzymes de restriction. Après digestion, l'ADN devrait être purifiée par l'extraction avec phenol/chloroform et la précipitation par Ethanol (voir le protocole ID#1453) ou par le kit de purification de Qiagen PCR. 2. Cy-dCTP et Cy-dUTP fonctionnent également bien. Si en utilisant Cy-dUTP, ajustez le mélange du dNTP 10X en conséquence. 3. Haut-concentration les unités de Klenow (40 à 50μl) produit étiqueter mieux. 4. ADN Cot-1 humaine bloque l'hybridation à DNAs réitéré qui peut être présent sur l'alignement 5. Le tRNA de levure bloque l'hybridation non spécifique d'ADN. 6. Poly(dA)-poly(dT) bloque l'hybridation aux queues de polyA des éléments d'alignement d'ADN. 7. Les volumes devraient être ajustés vers le haut en conséquence à de plus grandes glissades d'arrays/cover. 8. L'ADN de Genomic peut être étiquetée avec un protocole simple d'aléatoire-amoricage basé sur le lot d'étiquettes d'ADN de Gibco/BRL's Bioprime ; Des protocoles de traduction d'entaille peuvent également être utilisés. Le contribuant de ce protocole utilise par habitude le lot d'étiquettes de BioPrime (Gibco/BRL) comme source commode et peu coûteuse d'octamers, mémoire tampon de réaction, et haut-concentration aléatoires Klenow (n'utilisez pas le mélange de dNTP fourni dans le kit) ; d'autres sources d'amorces aléatoires et concentration élevée Klenow peuvent également être utilisées. |
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