Choisissez le protocole échoué d'isolement d'ADN de plasmide

Détails d'article

Détails d'article de protocoles »

Choisissez le protocole échoué d'isolement d'ADN de plasmide

Date ajoutée : 2 mars 2008 07:47 : 58 P.M.

Auteur : plinkadmin

Catégorie : Protocoles d'ADN

Choisissez la méthode pas à pas échouée de protocole d'isolement d'ADN de plasmide

1. Prenez une colonie bactérienne transformée avec le phagemid avec l'insertion de l'ADN d'intérêt d'un plat de livre contenant l'ampicilline. Employez une partie de l'inoculum pour faire une correction sur livre plaquer contenir l'ampicilline et employer le repos pour inoculer une culture de 2 ml de support de 2X YT. Assurez-vous qu'une quantité suffisante de la colonie le transforme en support de 2X YT.

2. Élevez la culture pour 2 à 3 heures ou jusqu'à la culture commence juste à regarder trouble. Ajoutez 5 ml (bactériophage 1 x 1012 par ml) des actions très concentrées du bactériophage d'aide (M13KO7).

3. Élevez la culture pour 6 heures à 37°C.

4. Ajoutez 1.5 ml de cette culture à un tube et à une centrifugeuse de microcentrifuge à 8.000 t/mn dans un microcentrifuge pour la minute 10 à 4°C pour granuler les cellules.

5. Introduisez à la pipette le 1 ml principal du surnageant dans un tube de microcentrifuge contenant le μl 500 de la solution de CHEVILLE de 13% (voir le conseil #2). Mélange doucement.

6. Incubez le tube à la température ambiante pour la minute 15 (mais plus).

7. Centrifugez le tube à à toute vitesse dans un microcentrifuge pour la minute 10 à l'écart 4°C. le surnageant.

8. Centrifugez brièvement dans un microcentrifuge pour réduire la solution résiduelle de CHEVILLE de 13%. Retirez cette solution résiduelle avec une pipette interminable de Pasteur.

9. Répétez l'étape #8 une fois pour retirer le bit final de la solution de CHEVILLE de 13%.

10. Resuspendez le granule bactériophage dans le μl 100 de TES ou de TE.

11. Incubez le bactériophage sur la glace pendant 10 mn.

12. Vortex le tube 3 fois.

13. Ajoutez le μl 60 du phénol et du vortex le tube pour sec 30.

14. Permettez au tube de se tenir pour 5 minimum et vortex de nouveau pour sec 30.

15. Centrifugez le tube dans un microcentrifuge à à toute vitesse pour la minute 10 à la température ambiante.

16. Enlevez le μl 80 du surnageant aqueux (la phase supérieure) et ajoutez-le à un tube de microfuge contenant le μl 5 de l'acétate de sodium de 3M.

17. Ajoutez le μl 200 de l'éthanol et du vortex le tube.

18. Incubez le tube pour la minute 15 à la température ambiante.

19. Granulez le précipité d'ADN par centrifugation dans un microcentrifuge pour la minute 10 à à toute vitesse à 4°C.

20. Retirez le surnageant et resuspendez le granule d'ADN en éthanol de 70%.

21. Repellet l'ADN par centrifugation dans un microcentrifuge pour la minute 10 à à toute vitesse à 4°C.

22. Éliminez l'éthanol et permettez au granule de sécher.

23. Resuspendez le granule d'ADN dans le μl 25 de TE et enregistrez-le à -20°C.

24. Contrôlez la préparation de plasmide en exécutant le μl 5 de la solution d'ADN sur un 0.7% gel d'agarose à 100 V (voir le protocole relatif à l'électrophorèse de l'ADN sur des gels d'agarose).

Choisissez les mémoires tampons échouées de protocole d'isolement d'ADN de plasmide

Solution de CHEVILLE de 13%		Stérilisez par filtration. polyéthylène glycol de 13% (poids/volume) (CHEVILLE) 8000 1.5 NaCl de M

support de 2X YT		NaCl de 5 g/liter tryptone de 16 g/liter extrait de levure de 10 g/liter Ajoutez à 900 ml ddH2O et secouez jusqu'à ce que les corps dissous se dissolvent. Ajustez le pH sur 7.0 avec du NaOH de 5 M. Apportez tout le volume à 1 litre avec ddH2O. Autoclave à stériliser.

Plats de livre avec l'ampère		agar de 15 g/liter NaCl de 5 g/liter extrait de levure de 5 g/liter Si frais, ajoutez l'ampicilline à une concentration finale de 40 μg/ml 1 ml/liter NaOH de 1 M Plaques de versement, mémoire à 4°C Autoclave. 10 g/liter Ttryptone

Acétate de sodium de 3M

éthanol de 70% (v/v)

Phénol (ATTENTION ! voir le conseil #1)

TES		10 millimètres de NaCl Tris-HCL de 20 millimètres, pH 7.5 EDTA de 0.1 millimètre

TE		10 millimètres de Tris-Cl, pH 8.0 EDTA de 1 millimètre

Réactifs requis
Tris Ampicilline Éthanol EDTA Extrait de levure Tryptone Bactériophage de l'aide M13KO7 Acétate de sodium Polyéthylène glycol (CHEVILLE) 8.000 Phénol Chlorure de sodium Agar Hydroxyde de sodium

Conseils de protocole
1. ATTENTION ! Cette substance est un biohazard. Consultez le MSDS de cet agent pour des instructions de manipulation appropriées. 2. Ou ajoutez le μl 300 de la CHEVILLE 8000 de 20% en NaCl de 2.5 M.

Estimations Vous devez être ouvert une session pour laisser une estimation.
Estimation moyenne : (voix 0)

Commentaires

Aucuns commentaires encore.

Vous devez être ouvert une session pour laisser une estimation.

Menu moléculaire de station

Bienvenue à la station moléculaire !

Vous devez s'enregistrer avant que vous puissiez signaler sur nos forum ou utiliser nos dispositifs avancés. Registre maintenant ! Son libre et rapide !

Déjà enregistré ? Procédure de connexion maintenant ci-dessous.