Protocole Électrophorétique de Réaction de Décalage de Gel de Mobilité d'EMSA

Protocole Électrophorétique de Réaction de Décalage de Gel de Mobilité d'EMSA

Protocole Électrophorétique de Réaction de Décalage De Gel de Mobilité d'EMSA

Observer un décalage de gel sur le gel de polyacrylamide

• 1. Préparez le gel comme suit :

1. 10.5 ml de solution d'Acrylamide/Bisacrylamide
2. 2.5 ml de mémoire tampon de 10X TGOE
3. 1.75 ml de glycérol de 50%
4. 20.9 ml de ddH2O
5. 0.3 ml de persulfate d'ammonium de 10% 30 l de TEMED

• 2. Moulez le gel et placez-le dans une chambre froide (4°C) approximativement 5 à 10 minutes avant de charger l'échantillon
• 3. Lavez les puits plusieurs fois avec 1 X TGOE (mémoire tampon fonctionnante).
• 4. Pré-exécutez le gel à 160 V pendant 15 minutes.
• 5. Lavez les puits hors de plusieurs fois avec 1 X TGOE encore.
• 6. Ajoutez le volume optimal de la mémoire tampon de chargement aux échantillons (le rapport de l'échantillon à la mémoire tampon de chargement devrait être déterminé empiriquement pour assurer la dilution adéquate du complexe de protein/DNA).
• 7. Commencez l'électrophorèse à 160 V.
• 8. Chargez les échantillons sur les puits du gel. Commencez le gel juste après charger les échantillons.
• 9. Electrophorese pendant approximativement 45 minutes.
• 10. À la fin de l'électrophorèse, retirez le gel et analysez le décalage de bande par Autoradiography

Solutions et mémoires tampons

• Ç$x TGOE de mémoire tampon de chargement
• 0.05% Bleu de bromophénol (voir l'extrémité 3)
• glycérol de 35% (v/v)

Ç$x TGOE de Mémoire tampon de Gel


glycérol de 50% (v/v)

ATTENTION de Solution d'Acrylamide/Bisacrylamide ! Voir l'Extrémité 2
0.33% (w/v) Bisacrylamide
acrylamide de 20% (w/v)
Préparez dans ddH2O juste avant l'utilisation


Acide acétique d'utilisation de la mémoire tampon de TGOE (10X) pH 8.2.
0.25 M Tris
1.9 Glycine de M


Mémoire tampon Obligatoire (5X) FACULTATIVE : ajoutez 25 μl du bleu saturé de bromophénol (approximativement 0.1% dans ddH2O par ml de mémoire tampon 5X obligatoire (BioRad) (voir l'extrémité 3)
25 millimètres de mgcl2
500 μg/ml BSA
300 millimètres de KCl
Enregistrez la mémoire tampon à -70°C.
glycérol de 20% (v/v)
100 millimètres Tris-HCl pH 8.0


Acide poly-[dG-dC]-Désoxyribonucléique

Les protéines de solution de protéine sont en général stables pendant les cycles gel-dégel répétés multiples.
Protéines de dégel rapidement sur la glace.
(x) protéine de mg/ml (voir l'extrémité 1) dans la mémoire tampon de dilution de protéine.


Persulfate d'ammonium du persulfate 10% (w/v) d'ammonium
Préparez dans ddH2O juste avant l'utilisation


Mémoire tampon 1 millimètre DTT de dilution de protéine
150 millimètres de KCl
glycérol de 10% (v/v)
albumine μde sérum de boeuf de 50 g/ml
20 millimètres Tris pH 7.9
Enregistrez la mémoire tampon de dilution à -70°C.


le DDT de 0.5M préparent dans ddH2O juste avant l'utilisation


le DDT de 0.1M préparent dans ddH2O juste avant l'utilisation

Matériaux

• Bleu de Bromophénol
• TEMED
• Glycérol
• Glace Sèche
• Persulfate d'Ammonium
• Tris
• Chlorure de Potassium
• Acrylamide
• Chlorure de Magnésium
• Acide Acétique
• p[dG-C.C ]
• DTT
• Glycine
• Poly [ dg-C.C ]
• Bisacrylamide
• Albumine de Sérum de boeuf

Extrémités de Protocole :

1. La quantité de protéine ajoutée doit être déterminée empiriquement et sera basée sur l'affinité de la protéine pour lier à l'ADN

2. ATTENTION ! Cette substance est un biohazard. Consultez le MSDS de cet agent pour des instructions de manipulation appropriées.

3. Le bleu de bromophénol peut gêner la protéine liant à l'ADN. Les effets de l'ajout du bleu de bromophénol devraient être déterminés empiriquement.