Préparation d'ADN de protocole bactériophage de lambda grande

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Préparation d'ADN de protocole bactériophage de lambda grande

Date ajoutée : 26 février 2008 03:54 : 09 P.M.

Auteur : plinkadmin

Catégorie : Protocoles d'ADN

Jour bactériophage un de préparation d'ADN de lambda le grand grandissent les bactéries d'une colonie (P2 par exemple) dans 25 mls livre avec 10mM MgSO4 et 0.2% partie aliquote 400ml de l'autoclave deux de maltose (dans des ballons de 2 litres) du T/MN, une fois refroidi ajoutent le maltose à 0.2% jour deux - la grande préparation bactériophage d'ADN de lambda à chacune de deux parties aliquotes de 10 ml de bactéries (de ci-dessus) ajoutent le bactériophage 10^7-10^8 (d'un lysate liquide) incubent dans des tubes de culture à 37oC pendant 20 mn ajoutent les bactéries/bactériophage à chacun des 400 mls des medias (de ci-dessus) et secouent à 300 t/mn, 37oC jusqu'à ce que le lysis commence (approximativement 6-8 heures mais dépend des bactéries/taux bactériophage ; pourrait prendre tant que 12 heures) --il est très important de saisir ceci quand le lysis commence ajoutent le chloroforme de 5 mls à chacun et continue de secouer pendant 15-30 mn --le chloroforme devrait lyser toutes les cellules ayant pour résultat la version des têtes bactériophages, cependant si on avait permis aux les cellules de terminer lyser toutes seules, le bactériophage libéré aurait eu le temps pour attacher sur des parties de membrane de cellules, injectant leur ADN dans la solution où il ne pourrait pas être récupéré ajoutent le NaCl de 23.5 g à chacun, se dissolvent par le tourbillonnement, a laissé se reposent dans la chambre froide pour la centrifugeuse de 15 mn à 10.000 g pour 10 la minute, 4oC de se débarasser des débris cellulaires. rassemblez le surnageant (en ce moment vous pouvez le laisser se reposer dans la chambre froide durant la nuit ou continuer) ajoutent la CHEVILLE (surnageant de 10% poids/volume) et remuent lentement dans la chambre froide pendant 1-2 heures. la rotation à 8000 que g pendant 20 mn resuspendent le granule/souillure en 10 ml de SM (5 à resuspendre, 5 pour laver des côtés de récipient) ajoutent la DNase de 55 ug, 50 ug de RNase, et ont laissé se reposer à à la température ambiante pendant 20 mn additionnent 7.8 g CsCl et tourbillonnent doucement jusqu'au transfert dissous au joint-un-tube et tournent dans l'ultracentrifugeuse pour 20 heures, 50K, 4oC ou 24 heures, 45K, 4oC identifient la bande blanche des têtes bactériophages et utilisent une aiguille et la seringue pour saisir cette bande (avant d'insérer l'aiguille au site de bande, perforez un trou au dessus du tube) dialysent contre un de large volume du SM au moins pendant 4 heures, changeant le SM deux fois.

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