Dirigez le protocole de conception pour la génération transgénique de souris

Protocole de conception de vecteur pour la génération transgénique de souris

1) longueur de viser des bras

1. Les études éditées par un groupe suggèrent que la taille minimum pour un bras de optimisation soit approximativement 0.5 kb, cependant, cette taille visant le bras produira la recombinaison homologue d'efficacité très basse. Les contribuants de ce protocole utilisent généralement une longueur de optimisation minimale de bras d'un côté de 1 kb, avec au moins le kb 2 ou 3 de l'autre côté. Il n'y a aucune raison pour laquelle les deux bras de optimisation ne peuvent pas être approximativement de la même longueur. Ils font généralement le les deux le kb approximativement 2 de optimisation de bras dans la taille (voir le conseil #1).

2. Les contribuants de cet de protocole ACP fréquemment que l'optimisation arme utilisant l'ADN genomic dérivée des cellules de RW-4 (129/SvJ) es, ou de l'ADN genomic copiée, si elle est d'une source 129/SvJ (voir le conseil #2 et #3). Quelques erreurs d'ACP semblent poser peu de (le cas échéant) problèmes pour la recombinaison homologue efficace. L'ACP facilite certainement les extrémités des fragments pour manipuler pour la mise en place dans contenir de vecteurs PGK-Néo-.

2) choisissent contre de doubles techniques de sélection

1. La plupart des éléments de optimisation dans le passé ont employé PGK-Néo- et HSV-TK pour exécuter sélection positive/négative. Cependant, le traitement de gancyclovir des cellules d'es est tout à fait toxique et les contribuants de ce protocole constatent qu'il affecte négativement la capacité des cellules d'es d'aller germline. Ils sont disposés à recevoir la cadence inférieure de la recombinaison homologue en échange d'une meilleure cadence de transmission de germline. Par conséquent, ils utilisent des vecteurs de simple-sélection avec PGK-Néo- exclusivement. Plusieurs différents genres de PGK-Néo- cassettes sont disponibles.

2. Les contribuants de ce protocole sont maintenant par habitude utilisant PGK-Néo- qui est flanqué des sites de Saumon fumé-p, de sorte que la PGK-Néo- cassette sélectionnable de repère puisse être retirée par CRE-recombinase pour éviter des problèmes potentiels avec le « voisinage effectue » de la PGK-Néo- cassette. Les travaux récents de leur laboratoire et d'autres ont suggéré que cet effet de voisinage soit très problématique dans le multigene groupe (voir les citations #1 et #2). Si le gène d'intérêt est dans une batterie de multigene, vous devrez prévoir les effets potentiels de voisinage de PGK-Néo- cassettes maintenues. Les PGK-Néo- cassettes flanquées par Saumon fumé-p et un plasmide d'expression de CRE-recombinase de haute performance (pTURBO-CRE) sont fournis par le contribuant de ce protocole (voir le protocole pour le déplacement des cassettes sélectionnables de repère des clones de Transfected es utilisant la recombinaison négociée parSaumon fumé).

3) détection des événements homologues de recombinaison

1. Bien que certains aient avec succès employé l'ACP pour détecter les recombinants homologues, les contribuants de ce protocole recommandent contre cette pratique. Ils recommandent vivement que vous développez une seule sonde qui est externe à l'optimisation s'ordonnance et l'employez pour examiner utilisant l'analyse méridionale. Elle n'importe pas si cette sonde soit ascendante ou descendant de l'élément de optimisation, il importe seulement qu'elle soit complètement externe, et qu'elle ne contient aucun élément réitéré d'ADN.

2. En plus de définir une bande homologue de recombinaison, l'analyse méridionale tient compte également de l'estimation du molarity des bandes de mutant, il est difficile faire que par ACP. Si les bandes de sauvage-type et de mutant ne sont pas égales dans l'intensité, vous devez être soupçonneux que le clone visé est souillé avec le sauvage-type cellules d'es. S'il est, le sauvage-type cellules aura un avantage quand elles sont injectées dans des blastocysts, et le résultat sera des mâles chimériques qui jettent la plupart du temps le sauvage-type chiots d'agouti. Ceci peut être un problème énorme. Si les bandes visées semblent correctes sur le méridional, mais le molarity est suspect, alors les contribuants de ce protocole recommandent vivement que les cellules soient resélectionnées dans G-418, ou même replaquées en limitant la dilution au subclone les cellules d'es d'intérêt.

4) génération des souris chimériques

1. Il y a plusieurs services disponibles pour faire les souris chimériques à partir des clones visés d'es (voir le conseil #4). Des services commerciaux et scolaires d'injection peuvent être consultés du « joint » la section du site Web du contribuant.

Extrémités de protocole

1. Il peut y a un avantage significatif en utilisant les bras sensiblement plus longtemps de optimisation ; cependant, il est plus difficile manipuler de grands éléments. Dans l'expérience des contribuants, l'optimisation des bras du kb approximativement 2 de chaque côté rapportera les efficacités homologues de recombinaison de 1 à 2%, qui sont adéquates pour la plupart des buts.

2. La variété de cellule embryonnaire de la tige du contribuant a été isolée dans les blastocysts 129/SvJ et s'appelle le RW-4. Un papier récent par Elizabeth Simpson et collègues au laboratoire de Jackson (voyez que la citation #3) a soigneusement évalué la variation génétique parmi tous les 129 substrains. Les contribuants de ce protocole recommandent vivement d'examiner ce document avant de commencer toutes les expériences. La large variété de variétés de cellule embryonnaires de tige qui peuvent être obtenues à partir de différents investigateurs peut être fortement divergente dans le fond 129. Choisissez ces variétés de cellule avec soin, puisqu'elles ne sont pas tout équivalentes. Il y a un certain nombre de différences allélomorphes entre les 129 substrains qui entraînent des différences mineures d'histocompatibilité, et il y a beaucoup de différences aux arrière-plans des 129 substrains (et même dans des variétés de cellule d'es obtenues à partir de ces contraintes).

3. De la note, une évaluation soigneuse du substrain 129/SvJ (laboratoire #000691 de Jackson), duquel les cellules RW-4 ont été faites, n'indiquent aucune différence allélomorphe entre les souris et les cellules RW-4. Par conséquent, aucune mutation évidente n'a été saisie pendant la préparation de la variété de cellule des contribuants.

4. Veuillez noter que vous devez avoir un protocole animal actif qui couvre les souris chimériques que vous recevrez sur le fichier avant que les injections puissent commencer.