La Cellule de Transfected Es de Cueillette Copie Le
Protocole
La Cellule de Transfected Es de Cueillette Copie - Le Jour 14
1. Dégelez les cellules electrocompetent
sur la glace.
2. Refroidissez les cuvettes et les tubes de
microcentrifuge contenant l'ADN.
3. Dans un tube à centrifuger stérile de 15 ml,
mélangez 1 ml de solution de livre Electroporation.
4. Contrôlez l'installation du matériel
d'electroporation. Assurez-vous que le contrôleur d'impulsion
est branché et réglé à 400. Placez la capacité à la
tension de 25 F. Set à 2.5 kilovolts (maximum).
5. Juste avant l'electroporation de chaque
échantillon, remplissez Pasteur introduisent à la pipette et ampoule
avec le 1 ml de mélange de livre dans le tube de 15 ml.
6. Prenez les cellules vers le haut en 200 l
extrémité, mélangez à de l'ADN et au transfert dans la cuvette en
vidant l'extrémité en bas d'un côté de la cuvette. (conseil
# 1).
7. Effacez n'importe quelle humidité des côtés de
la cuvette.
8. Placez la cuvette dans le support de cuvette et
appuyez sur les deux boutons rouges simultanément jusqu'à ce que le
signaleur retentisse. (conseil # 2).
9. Laissez les cellules secouer à 255 t/mn pendant
45 à 60 minutes à 37°C.
10. Le après utilisation, rincent immédiatement
les cuvettes complètement par de l'éthanol de ddH2O et de 95%.
Laissez l'air de cuvettes sec.
11. Plaquez 10 l de la suspension de cellules sur
les plats de livre contenant l'antibiotique approprié pour le
plasmide. (conseil # 3).
12. Ajoutez le reste de la suspension de 1 ml à 5
ml de livre contenant l'antibiotique approprié. Ajoutez 2.5 ml
à un tube stérile, et le repos à un autre tube stérile.
13. Accroissez les cultures durant la nuit (12 à 16
heures) à 37°C dans un incubateur de secousse à 225 t/mn.
14. Partie aliquote 1 ml par tube de microcentrifuge
pour un total de 4 tubes de microcentrifuge (voir le conseil # 4).
15. Préparez l'ADN de plasmide par le procédé de
miniprep. (voir le protocole relatif à la préparation d'ADN de
plasmide). Resuspendez l'ADN de plasmide en volume de 75 l de
TE.
16. Assimilez 1 l du miniprep en utilisant 40
unités de l'enzyme de restriction qui représente le seul site dans
le plasmide initial en volume total de 40 l. (voir le protocole
relatif à la digestion d'enzymes de restriction).
17. Incubez la réaction de digestion pendant 2.5 à
4 heures.
18. Electrophorese 2 l du mélange de sommaire de
restriction sur un gel d'agarose pour contrôler que l'échantillon
apparaît a entièrement assimilé (voir le protocole pour l'ADN
d'Electrophoresing sur un gel d'agarose).
19. Purifiez l'ADN dans le reste du mélange de
réaction (voir le protocole relatif à la purification de l'ADN de
plasmide) (voir le conseil # 5).
20. Utilisez 0.3 l pour la transformation dans les
cellules DH5 (voir le protocole relatif à la transformation).
Plaquez 5 l et 50 l sur des plats de livre contenant
l'antibiotique approprié.
21. Sélectionnez les colonies et isolez l'ADN de
plasmide. (voir le protocole relatif à l'isolement d'ADN de
plasmide).
22. Assimilez l'ADN avec de l'enzyme de restriction
qui ne coupera pas le plasmide nouvellement subi une mutation.
(voir le protocole relatif à la digestion d'enzymes de
restriction).
23. Ordonnancez ceux copie qui ne sont pas
assimilés par l'enzyme spécifique de restriction dont le site a
été subi une mutation (voir le protocole relatif à ordonnancer
l'ADN). Ce sont copie qui devraient contenir la mutation
site-dirigée (conseil # 6).
Solutions et mémoires tampons
Cellules electrocompetent du mut S des cellules
BMH 81-17 du mut S des cellules BMH 81-17 du mut S de BMH 81-17
Voir le protocole relatif à faire les cellules
electrocompetent
Mémoire tampon 10 millimètre Tris de TE
pH 8.0
EDTA de 1 millimètre
Plats de Livre
Mémoire de plats de livre à 4°C jusqu'à ce que
nécessaire
Bacto-agar de 15 g/liter
Laissez frais à 50°C avant d'ajouter tous les
antibiotiques.
Préparez en livre
Le flacon de remous et versent le plat
d'approximativement 30 ml/petri (100 millimètres).
Laissez les medias réglés.
éthanol de 95% (v/v)
Stérilisez par la stérilisation à l'autoclave
pendant 20 minutes à une pression de pouce de 15 pounds/square sur le
cycle liquide.
Bouillon de Luria (livre) NaCl de 5 g/liter
extrait de levure de 5 g/liter
tryptone de 10 g/liter
1 ml/liter NacOh de 1 M
NacOh de 1 M
Solution de livre Electroporation 1 ml de mémoire
tampon de livre
10 millimètres de sulfate de magnésium
0.4% glucose (w/v)
Cellulesα DH5
DH5α cellules electrocompetentα des cellules DH5
Voir le protocole relatif à faire les cellules electrocompetent
BioReagents et produits chimiques :
- EDTA
- Sulfate de Magnésium
- Tris
- Hydroxyde de Sodium
- Chlorure de sodium
- Bacto-Agar
- Extrait de levure
- Tryptone
- Antibiotique
- Éthanol
- Glucose
Extrémités de Protocole :
1. Tapez les cellules vers le bas au bas de la
cuvette de sorte que les cellules forment une couche uniforme d'un
côté à l'autre. Essayez d'éviter tous les grands bulles
d'air.
2. La constante de temps devrait être de 7.0 à 7.5
millisecondes en tant que moins de 6.5 millisecondes donnent la
viabilité réduite, moins de 4 donne une petite explosion,
généralement d'une concentration ionique trop élevée dans les
échantillons. Si la constante de temps est 8 plus grands que,
l'efficacité de l'electroporation est basse. Si un quelconque
de ces conditions résultent, prenez une cuvette, un échantillon, des
cellules et un essai frais encore. Autrement, contrôlez la
compétence des cellules et repurify l'ADN.
3. Cette étape est employée pour contrôler
l'efficacité d'electroporation. La fréquence d'electroporation
de l'ADN linéaire est au sujet d'mille-plient moins efficace que
l'ADN circulaire de plasmide. Puisqu'une partie considérable de
l'ADN sera linéaire en utilisant ce protocole, l'efficacité globale
par microgramme d'ADN sera moins que l'efficacité prévue habituelle.
4. Si vous avez beaucoup de différents mutants,
deux tubes de microcentrifuge par clone de mutant suffiront.
5. Les contribuants de ce protocole purifient l'ADN
en chargeant le reste du mélange de sommaire de restriction sur une
colonne du biogel™ P10. Épurez conformément aux
recommandations du constructeur.
6. Pour les changements de base simples de l'ADN de
cible, habituellement 100% des minipreps choisis aura le bon ordre
subi une mutation. Pour des mutations plus compliquées, cette
fréquence change de 10 à 100%. |
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