La cellule de Transfected es de cueillette copie le protocole

La cellule de Transfected es de cueillette copie le protocole

Clones de cellules de Transfected es de cueillette

La cellule de Transfected es de cueillette copie le jour 14

1. Commencez ce protocole pendant six jours après electroporating les cellules d'es (voir le protocole relatif à l'électroporation des cellules d'es).
2. Visualisez les 10 paraboloïdes de cm contenant les cellules transfected d'es par le microscope inversé. Les clones sont visibles en tant que petits emboîtements des cellules rapidement croissantes. Ils ont les cadres serrés et sont étroitement emballés. De plus grandes cellules dans la colonie, avec les membranes bien définies sont les cellules qui commencent à différencier. Ne sélectionnez pas ces clones ! C'est le jour 6 du processus de sélection. Si les clones sont assez grands vous pouvez sélectionner ce jour, ou attente jusqu'au jour 7.
3. Pour sélectionner les clones, installez un microscope inversé dans un capot d'écoulement laminaire.
4. Préparez les 24 plats bons (faits dans section D du protocole sur l'électroporation des cellules d'es) en sortant les vieux medias et le remplacement par des medias de sélection de 1.0 ml es par puits.
5. Placez les cinq 24 paraboloïdes bons de nouveau dans l'incubateur.
6. Remplacez les medias de sélection d'es dans paraboloïde le de 10 premier cm par des medias frais de sélection d'es.
7. Placez le paraboloïde sous le microscope et visualisez les cellules au rapport optique 4X et 10X. Essayez d'être sûr d'identifier seulement les clones qui n'ont pas encore commencé à différencier (voir le conseil #1). Isolez le clone à sélectionner dans le domaine de visionnement.
8. Utilisant une extrémité de pipette de barrière de 0 à 160 μl, poussez doucement le clone d'es en avant du MEFs environnant. Avec le pipettor placez entre le μl 30 et 50, et le bouton de plongeur déjà enfoncé, plument le clone utilisant un mouvement de excavation vers l'avant d'aspiration. Si le pipettor est placé sur le μl 30, il devrait y avoir assez d'aspiration pour déloger le clone du plat. Cependant, si la couche inactivée de force expéditionnaire des Marines est trop dense, il peut être difficile de déloger les clones d'es. Dans ce cas-ci, taquinez soigneusement le MEFs environnant à partir du clone sans perturber le clone avec l'extrémité de pipettor. Moissonnez alors les clones.
9. Placez chaque clone dans un des 24 puits contenant des medias de sélection d'es.
10. Continuez à sélectionner les clones et l'endroit dans les puits des 24 plats préparé de puits jusqu'à ce que 12 clones soient sélectionnés ou le paraboloïde de 10 cm a été hors de l'incubateur pour la minute 15 (voir le conseil #2).
11. Placez le plat contenant les clones sélectionnés dans l'incubateur.
12. Continuez de sélectionner des clones jusqu'à ce que chacun des 24 puits ait été complété tous les paraboloïdes préparés (voir le conseil #3).
13. Placez les 24 paraboloïdes bons dans l'incubateur durant la nuit.
14. Voyez le protocole relatif à Dissaggregation, à expansion, et à la congélation des clones de Transfected es.

BioReagents et produits chimiques :

• Acides aminés non essentiels
• Le support de l'aigle modifié de Dulbecco (DMEM)
• HEPES
• G-418 (Geneticin)
• 2-Mercaptoethanol
• ESGRO (facteur inhibiteur de leucémie murine, LIF)
• L-Glutamine
• Sérum foetal de veau (FCS), la chaleur inactivée

Extrémités de protocole :

1. Après électroporation et sélection ultérieure, il est important de sélectionner soigneusement les clones stables pour l'expansion postérieure et l'analyse d'ADN. Copie (qui contiennent beaucoup de petits emboîtements des cellules) devrait augmenter dans la taille pendant la sélection mais ne pas subir la différentiation. Les cellules empileront vers le haut et mettront à jour une colonie discrète sur les cellules de conducteur. Les cellules dans un clone adhéreront étroitement à un un autre, le rendant difficile de voir différentes cellules ; un cadre serré devrait entourer le clone. Les clones d'es se développeront bien sur la couche de conducteur de force expéditionnaire des Marines, formant de diverses formes, telles qu'oblong ou triangulaire. Des clones qui montrent l'hétérogénéité cellulaire, telle que la formation endodermale de cellules sur la surface libre d'extérieur de la colonie, ou une propagation des cellules à la périphérie et l'aplatissement général, ne devraient pas être choisis.

2. Les clones sont sensibles au pH et aux changements de température.

3. Si vous ne pouviez pas sélectionner tous vos clones le jour 6 de la sélection, vous pouvez continuer à sélectionner le jour 7. de sélection. Les contribuants de ce protocole ne recommandent pas de sélectionner des clones le jour 8.