Protocole de ligature d'ADN

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Protocole de ligature d'ADN

Date ajoutée : 11 avril 2008 10:15 : 50 P.M.

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Catégorie : Protocoles d'ADN : Clonage d'ADN

Protocole de ligature

1. Installez le DNAs en ajoutant le suivant dans un tube de microcentrifuge :
   0.1 à 0.2 vecteur préparé par μg (voir le conseil #1)
   1 - à l'excès molaire de 3 fois de l'insertion préparée
   Ajoutez ddH2O pour donner un volume final de μl 6.1
   Veillez à installer une commande négative qui manque de l'ADN d'insertion (voir le conseil #2).

2. Chauffez le DNAs dilué à 68°C pendant 3 minutes (voir le conseil #3).

3. Placez immédiatement les tubes sur la glace.

4. Préparez le cocktail de réaction de ligature en ajoutant le suivant dans la commande dans un tube de microcentrifuge sur la glace :

   Ajoutez par réaction cohésive de ligature de fin :
   1 μl de mémoire tampon de la ligase 10X
   0.5 μl de triphosphate d'adénosine de 10 millimètres
   0.1 μl de 10 mg/ml BSA acétylé (NEB)
   0.3 μl de 1 ligase d'ADN de Weiss Unit/μl T4 (USB) (voir le conseil #4)

   - OU

   Ajoutez par réaction de ligature d'extrémité franche (voir le conseil #5) :
   1 μl de mémoire tampon de la ligase 10X
   0.3 μl de triphosphate d'adénosine de 10 millimètres
   0.1 μl de 10 mg/ml BSA acétylé (NEB)
   μl 2 de la CHEVILLE 8000 de 40% (voir le conseil #6)
   0.3 μl 6.66 de ligase d'ADN de Weiss Units/μl T4 (Nouvelle Angleterre Biolabs)

5. Ajoutez le cocktail préparé dans l'étape #4 au DNAs sur la glace.

6. Incubez à 16°C pour 1 heure.

7. Facultatif : S'il est possible, installez un sommaire de restriction du mélange de ligature utilisant une enzyme de restriction que les coupes dans le vecteur commençant mais ne coupe pas le produit ligaturé. Ceci choisira contre des non-recombinants (voir le conseil #7).

8. Transformez Escherichia coli compétent avec 0.5 μl au μl 2 du mélange de ligature (voir le protocole ID#568).

Mémoires tampons de ligature

Mémoire tampon de ligase (10X)		Tris-HCL de 660 millimètres, pH 7.6 Faites frais toute les semaine 2 à 3 66 millimètres de mgcl2 100 millimètres DTT

10 mg/ml BSA acétylé

CHEVILLE 8000 de 40%		polyéthylène glycol de 40% (poids/volume) MW = 8.000

Les matériaux ont eu besoin pour la ligature

Tris
Ligase d'ADN, T4
DTT
BSA acétylé
Oligonucléotide
Polyéthylène glycol (CHEVILLE) 8.000
Triphosphate d'adénosine
Chlorure de magnésium

1. Avant la ligature, le fragment de vecteur est souvent traité avec de la phosphatase alkaline pour enlever les 5 ' résidus de phosphate afin d'empêcher l'individu-ligature du vecteur. Il est particulièrement important faire ce si le vecteur a été coupé seulement une fois, laissant les extrémités compatibles.

2. En outre, une commande négative qui manque de l'ADN de vecteur est utile dans les cas où des insertions pourraient être souillées avec des fragments de vecteur.

3. Ceci fond toutes les extrémités cohésives qui ont pu avoir recuit.

4. Une unité de Weiss est la quantité dont d'enzyme catalyse l'échange de 1 nmole [^32P] de pyrophosphate dans le γ, le β- [^32P] - triphosphate d'adénosine en la minute 20 à 37°C.

5. Pour des ligatures d'émoussé-fin, elle aide probablement à utiliser plus de ligase et moins de triphosphate d'adénosine que des ligatures cohésives ou « collantes » de fin, comme indiqué.

6. La CHEVILLE empêche la transformation ; la ramener au μl 1.0 par ligature peut avoir des résultats similaires.

7. Ceci est connu comme une « coupe de tueur. » Le raisonnement pour des coupes de tueur est que n'importe quelle contamination avec le vecteur commençant religated ou le vecteur commençant intact sera linéarisée et transformera ainsi des bactéries beaucoup moins efficacement que le produit intermoléculaire circulaire de ligature. Par exemple, si un BGL II-assimilait l'insertion est copiée dans un site de BamHI dans un vecteur et l'insertion elle-même ne contient aucun site de BamHI, puis après ligature, BamHI peut être employé pour linéariser n'importe quel vecteur qui religated sans insertion. Ces fragments de vecteur qui ont ligaturé avec l'insertion ont détruit le site de BamHI et sont maintenant protégés contre l'activité enzymatique de restriction.

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