Spectroscopie d'absorption et quantification de protocole bactériophage filamenteux

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Spectroscopie d'absorption et quantification de protocole bactériophage filamenteux

Date ajoutée : 11 avril 2008 09:51 : 59 P.M.

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Catégorie : Protocoles viraux de manipulation : Protocoles bactériophages

À la différence du bactériophage sphérique, tel que T4 et λ, qui ont des taux de poids rudement égaux de protéine à l'ADN, le bactériophage filamenteux ont environ six fois plus de protéine que l'ADN ; la protéine contribue donc sensiblement au spectre d'absorption. Basé sur les mesures du jour et du Wiseman, la concentration du bactériophage dans virions/ml est comme vue. La soustraction de l'A320, une longueur d'onde où il y a peu d'absorption de la lumière des chromophores bactériophages, est censée pour corriger crûment pour la dispersion de la lumière des particules bactériophages et des contaminants non-bactériophages de particules.

Protocole

1. Préparez une dilution séquentielle (dans 1X TBS) du bactériophage filamenteux pour être analysé si évidemment la solution est trop concentrée pour l'analyse d'absorption.

2. Assurez-vous que les surfaces extérieures de deux cuvettes de quartz sont propres (particulièrement la fenêtre par laquelle la lumière voyagera, voit l'extrémité #1).

3. Allumez le spectrophotomètre et permettez à l'instrument de réchauffer pendant une période appropriée (référez-vous aux instructions du constructeur).

4. Programmez le spectrophotomètre pour analyser un spectre de 240 nanomètre à 320 nanomètre et pour enregistrer également la valeur d'absorbance à 269 nanomètre et à 320 nanomètre.

5. Ajoutez le μl 250 à 1 ml de 1X TBS (selon la cuvette) aux cuvettes nettoyées et placez une des cuvettes dans la cellule de référence et l'autre dans la cellule d'analyse.

6. Masquez le spectrophotomètre.

7. Retirez la cuvette de la cellule d'analyse et aspirez le 1X TBS.

8. Ajoutez une des solutions à analyser dans la cuvette.

9. Placez la cuvette dans la cellule d'analyse et déterminez le spectre de spectrophotomètre (voir l'extrémité #2).

10. Répétez les étapes #7 à #9 pour les échantillons restants.

Mémoires tampons

TBS (10X)

Mémoire à la température ambiante
Tris-HCL pH 7.5 de 500 millimètres
1.5 NaCl de M

Matériaux

Tris-HCL
Chlorure de sodium

Extrémités de méthode

1. Nettoyez deux cuvettes de quartz en lavant l'extérieur de la cuvette avec du méthanol 100%.

2. Un spectre d'absorption UV typique de bactériophage filamenteux épuré s'est dissous dans des résultats de TBS dans un large plateau à 260 à 280 nanomètre, avec un maximum peu profond à 269 nanomètre

Références

Jour, L.A. et Wiseman, R.L. Une comparaison de l'ADN empaquetant dans les virions de FD, de Xf, et de Pf1. Dans : Les bactériophages monocatenaires d'ADN. (1978) (Denhardt, D.T., Dressler, D. et rayon, ed de D.S.) P. 605-625.

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