Cystéine de couplage contenant des peptides à la protéine de porteur pour l'immunisation et l'anticorps polyclonal

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Cystéine de couplage contenant des peptides à la protéine de porteur pour l'immunisation et l'anticorps polyclonal

La date a ajouté : 11 avril 2008 09:30 : 46 P.M.

Auteur : plinkadmin

Catégorie : Protocoles de peptide

L'ordre de peptide doit contenir des acides aminés de cystéine pour que l'agent de réticulation couple efficacement les peptides à la protéine de porteur (RSA). Une fois que couplé, le conjugé de protéine de peptide-porteur peut être employé dans un programme des injections pour obtenir une immuno-réaction chez les lapins contre l'ordre de peptide. 1. Préparez les programmes fins de Sephadex G-25 en les gonflant durant la nuit en 0.1 M NaH2PO4, pH 6.0 à la température ambiante (mémoire tampon de 5 ml/gramme sec des programmes). 2. Lavez la résine 4 fois utilisant 0.1 M NaH2PO4, pH 6.0. 3. Versez Sephadex G-25 dans des 130 millimètres X colonne ou équivalent de 20 millimètres. 4. Lavez avec 15 ml de 0.1 M NaH2PO4, pH 6.0 pour équilibrer la colonne et pour arranger la résine en colonne. 5. Ajoutez le SMCC goutte-à-goutte à la solution de la RSA avec le mélange (voir le conseil # 2 et #4). 6. Incubez le mélange à la température ambiante sur un mélangeur tournant pendant 30 mn 7. ajoutent le μl 200 du diméthylformamide (DMF) à 1 ml de 0.1 M NaH2PO4, pH 6.0 8. dissolvent mg 5 du peptide Cystéine-contenant en 0.1 M NaH2PO4, l'étape #7. 9. de forme de solution de pH 6.0/DMF incubent à la température ambiante jusqu'à ce que prêt à coupler. 10. Ajoutez 1 ml de 0.1 M NaH2PO4, pH 6.0 au conjugé de SMCC-RSA et mélangez bien. 11. Chargez le conjugé sur la colonne de Sephadex G-25. 12. Employez 0.1 M NaH2PO4, pH 6.0 comme mémoire tampon de colonne et écoulement par gravité pour rassembler des fractions de 1 ml dans des tubes de 1.5 ml. 13. Rassemblez 12 fractions totales (voir le conseil #5). 14. Analysez chaque fraction par analyse de Bradford de plat de micro-titre pour la protéine utilisant le μl approximativement 2 de chaque fraction (voir le protocole relatif à la détermination de concentration en protéine utilisant l'analyse de Bradford de plat de micro-titre). 15. Mettez les fractions maximales du conjugé de SMCC-RSA dans un tube conique de 15 ml. 16. Ajoutez la solution dissoute de peptide (d'étape #9) au tube. 17. Incubez le tube pour 12 à 16 heures à la température ambiante sur une roue de mélange tournante (voir le conseil #6). 18. Dialysez le conjugé de SMCC-RSA-peptide pour 24 heures contre 1 litre de PBS avec 2 modifications de mémoire tampon à 4°C. Le poids moléculaire de l'utilisation 3.500 a découpé la tuyauterie de dialyse. (voir le conseil #7). 19. Divisez l'échantillon en 400 parties aliquotes de μl et l'enregistrez à -80°C. 20. Pour produire des anticorps, employez le μl 100 du conjugé de porteur-éditeur-peptide par injection de lapin toutes les trois semaines avec l'adjuvant de Freund (voir le protocole pour la préparation des anticorps polyclonaux). 0.1 M NaH2PO4, pH 6.0 0.1 Phosphate de sodium de M monobasique, pH 6.0 PBS (10X) 1.4 NaCl pH 7.2 de M 30 millimètres de KCl mis-bande dibasiques monobasiques de phosphate de sodium de 40 millimètres de phosphate de potassium de 20 millimètres (KH2PO4) (Na2HPO4) Préparé dans le μl 150 du diméthylformamide (DMF) facultatif : préparez SMCC OU mis-bande (voir le conseil #2) 1 ester de m-Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimide de mg (mis-bande) (Pierce) SMCC Préparé dans le μl 150 du diméthylformamide (DMF) (l'ATTENTION voient le conseil #3) 1 mg Succinlmidyl 4 [n-Maleimidomethyl-Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC) (Pierce) facultatif : préparez SMCC OU mis-bande (voir la ventouse de trou de la serrure du conseil #2) Hemocyanin (KLH) ventouse de trou de la serrure de mg 4 Hemocyanin facultatif : préparez la RSA OU KLH (voir le conseil #1) dissous en 0.3 ml de 0.1 M NaH2PO4, pH 6.0 dialysent durant la nuit contre 0.1 M NaH2PO4, l'albumine sérique de lapin de pH 6.0 (RSA) Facultatif : préparez la RSA OU KLH (voir le conseil #1) dissous en 0.3 ml de 0.1 M NaH2PO4, pH 6.0 dialysent durant la nuit contre 0.1 M NaH2PO4, phosphate de potassium d'albumine sérique de lapin de mg 4 de pH 6.0, phosphate de sodium monobasique, ventouse de trou de la serrure auxiliaire d'ester de m-Maleimidobenzoyl-N-Hydroxysuccinimide de chlorure de sodium de chlorure du potassium de Freund dibasique Hemocyanin Succinlmidyl 4 [phosphate de sodium d'albumine sérique de lapin de n-Maleimidomethyl-Cyclohexane-1-Carboxylate Dimethylf monobasique…

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